До настоящего времени против возбудителей многих инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, таких, как гемофилез, листериоз, пастереллез, некробактериоз, и некоторых других отсутствуют эффективные вакцины [11]. Причина этого, по-видимому, в том, что использовавшиеся для их конструирования технологии исчерпали свои возможности. В связи с этим мы решили ознакомить ветеринарных специалистов с накопленными за последние годы данными об иммуномодулирующей активности порообразующих белков (поринов) бактерий.

Протективные свойства пориновых белков бактерий. Порины — белки клеточной стенки грамотрицательных бактерий, они образуют заполненные водой поры (каналы) и способствуют неспецифическому прохождению через внешнюю мембрану веществ с относительно невысокой молекулярной массой [1, 5].

Топологически порины занимают трансмембранное положение. Они пронизывают липидный бислой наружной клеточной стенки и проникают через периплазматическое пространство до пептидогликана, но не взаимодействуют с ним [5].

Протективные свойства поринов отдельных возбудителей инфекционных болезней приведены в таблице.

Результаты исследования протективных свойств пориновых белков бактерий

Этиологический агент и вызываемые им болезни людей и животных	Недостатки антигенов, используемых для конструирования вакцин	Протективные свойства пориновых белков бактерий	Источник
Haemophilus influenzae В (HiB) — менингит у детей, гемофилезная плевропневмония свиней	Штаммоспецифичность иммунного ответа на введение существующих вакцин. Иммунная система детей до 2 лет практически не отвечает на вакцины на основе капсульного полимера	ЕJ. Hartsen et al. показали, что один из мембранных поверхностных белков HIB, молекулярной массой 39 кД, способен индуцировать выраженный иммунный ответ у молодых кроликов к большинству штаммов HiB. В дальнейшем установили, что данный белок (обозначенный как Р2) является порином	18, 20
Salmonella typhimurium — брюшной тиф у людей	Неполный защитный эффект, штаммоспецифичность иммунного ответа, большое количество противопоказаний к применению убитой вакцины	N. Kuusi et al., используя для иммунизации порин S. typhimurium, повысили титр антипориновых антител в сыворотке крови иммунизированных мышей в 100 раз по сравнению с исходным. При этом индекс защиты в зависимости от штамма возбудителя, использованного для заражения, составлял от 8,2 до 32,0	23, 24
Neisseria meningitidis — менингит у людей	Малая иммунногенность капсульных полисахаридов менингококков. Сходство структур, образуемых полисахаридами капсул менингококков группы В со структурами, формируемыми гликопротеинами на поверхности нейрональных клеток мозга человека	W.D. Zollinger et al. впервые установили способность вакцин, включающих порообразующие белки классов 1 и 2/3, индуцировать высокий титр бактерицидных и гемагглютинирующих антител у кроликов и защищать мышей от гибели после инфицирования культурой менингококка группы В типа 2. В последующих экспериментах показано, что только в отношении белков данных классов удалось получить моноклональные антитела, обладающие выраженной бактерицидной активностью	29, 31
Neisseria gonorrhoeas — гонорея у людей	Вакцинные препараты не созданы. Антигенная структура гонококков неоднородна и подвержена постоянным изменениям	По данным К. Zak et al., в отличие от других поверхностных антигенов возбудителя гонореи пориновый белок не подвергается антигенному дрейфу в ходе инфекционного процесса. По данным J.Е.Heckels et al., порин Р1способен индуцировать выработку антител, обладающих бактерицидным действием в отношении различных серотипов N. gonorrhoeas	21, 30
Pseudomonas aeruginosa — синегнойная инфекция у людей и животных; псевдомоноз пушных зверей	Вакцины на основе убитых клеток, жгутиковых антигенов, а также ЛПС реактогенны, иммунный ответ штаммоспецифичен	Н.Е. Gilleland et al. показали, что при двукратной иммунизации мышей белком F (порин P. aeruginosa) в дозе 10 мкг/животное с последующим инфицированием 3 LD 50 возбудителя синегнойной инфекции количество выживших животных составляло 90–100% в зависимости от штамма, выбранного для заражения. В другой работе Н.Е. Gilleland et al. доказали возможность получения протективного эффекта при хронической легочной инфекции кроликов, моделирующей легочный фиброз у людей. Иммунизация белком F защищала кроликов от 6 (из 6 имеющихся в распоряжении авторов) иммунотипов Р. aeruginosa. F-белок стимулировал образование IgG и IgM, реагирующих с клеточными оболочками всех штаммов Р. aeruginosa	14, 15
Pseudomonas mallei — сап у людей и лошадей	Вакцинные препараты не разработаны. Переболевшие животные остаются восприимчивыми к повторному заражению	Исследование протективного действия поринового белка возбудителя сапа показало, что он способен индуцировать у золотистых хомячков иммунитет, обеспечивающий их невосприимчивость к последующему заражению различными штаммами P. mallei. В зависимости от схемы иммунизации и дозы вводимого антигена индекс защиты находился в пределах от 8,6 до 14,1	2, 8, 9
Pseudomonas pseudomallei — мелиоидоз у людей и животных	Вакцинные препараты не разработаны	Доказательства возможности получения протективного эффекта порина P. Pseudomallei при экспериментальном мелиоидозе получены в опытах на золотистых хомячках и крысах. Индекс защиты для однократно иммунизированных хомячков колебался в пределах 12,5–28,0 и зависел от дозы использованного для иммунизации антигена	3
Legionella pneumophilla — легионеллез у людей	Вакцинные препараты на основе аттенуированных живых штаммов и ЛПС не обладают защитным действием при аэрогенном заражении возбудителем легионеллеза экспериментальных животных	Основной белок внешней мембраны L. pneumophilla (порин с молекулярной массой 39 кД) способен индуцировать иммунитет, защищающий морских свинок от аэрогенного заражения 5...10 LD 50 возбудителя легионеллеза	10
Yersinia pseudotuberculosis — псевдотуберкулез у людей и животных	Вакцинные препараты на основе убитых клеток малоэффективны и защищают только в отношении возбудителя определенного серовара	Индекс защиты для иммунизированных иерсинином мышей (порин псевдотуберкулезного микроба), инфицированных бактериями псевдотуберкулеза первого и третьего сероваров, составлял от 100 до 1000 в зависимости от схемы иммунизации и штамма, выбранного для инфицирования	5

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о высоких протективных свойствах порообразующих белков бактерий разных видов. В то же время их уникальная структура, топология и функция предполагают наличие особенностей иммунного ответа, которые необходимо учитывать при разработке ветеринарных вакцин.

Видоспецифичность иммунного ответа отмечали практически все исследователи [5, 6, 14, 15, 18, 21, 23, 26], это обусловлено консервативностью структуры пориновых белков [1, 5]. Большинство возбудителей инфекционных болезней животных, в отношении которых нет эффективных вакцин (возбудители гемофилеза, псевдомоноза, псевдотуберкулеза и др.), серологически неоднородны, поэтому использование порообразующих белков бактерий для иммунизации позволит избежать приготовления вакцинных препаратов из комбинации антигенов, индуцирующих штаммоспецифический иммунный ответ (убитые клетки, ЛПС, жгутики, альгинат).

Преобладание клеточного звена в иммунном ответе на введение порина. К. Matsui, T. Arai (1989) отмечали усиление гиперчувствительности замедленного типа и повышение синтеза интерлейкина-2 у иммунизированных порином животных. Т-клетки, перенесенные ими от иммунных животных к неиммунным, способны предотвращать развитие сальмонеллезной инфекции [25, 26, 27]. Авторы считают, что клеточный иммунитет играет основную роль в предотвращении инфекционного процесса у животных, иммунизированных поринами [25, 26].

Связь иммунного ответа с конформацией антигена . И.С. Тартаковский и соавт. (1993) показали, что присутствие в иммунизирующем препарате липополисахаридного компонента, ковалентно связанного с порином, повышало протективный эффект в отношении возбудителя легионеллеза [10]. Опыты N. Kuusi et al. (1981) прояснили механизм этого явления [24]. По их данным, сыворотка кроликов, иммунизированных порином с полностью удаленным ЛПС, не обладала протективным действием при инфицировании животных возбудителем брюшного тифа. Однако они наблюдали выраженное защитное действие сыворотки кроликов, иммунизированных порином, содержащим следовые количества ЛПС, но из которой антитела к ЛПС были затем удалены. Авторы сделали вывод, что следовые количества ЛПС в препаратах поринов, используемых для иммунизации, необходимы для сохранения конформационных эпитопов на поверхности комплексов, образуемых в результате олигомеризации субъединиц порообразующих белков [24].

Полиэпитопность поринового белка заключается в том, что клетки иммунной системы могут воспринимать один пориновый белок как несколько антигенов в зависимости от стадии инфекционного процесса. Так, специфические антитела к поверхностным белкам HiB обнаружили в сыворотке крови детей, перенесших HiB-менингит. Интересно, что антитела к экспонированным на поверхности HiB белкам регистрировали только в сыворотке реконвалесцентов. У больных с острой стадией болезни в сыворотке выявляли антитела к антигенам, которые не были для них доступны на поверхности бактериальных клеток в экспериментах in vitro [17]. Некоторую ясность внесли опыты, в которых для дифференциации антигенов использовали моноклональные антитела (мАТ). Установили, что детерминантой межштаммового иммунного ответа макроорганизма на HiB являлся поверхностный белок с молекулярной массой 39 кД. Последний способен индуцировать 5 типов мАТ, из которых только один тип взаимодействовал со своим эпитопом на поверхности бактериальной клетки. Остальные эпитопы функционировали после процессинга иммунной системы хозяина [28]. Данная особенность иммунного ответа — это следствие сложной четвертичной структуры пориновых белков бактерий.

Отношение к адъювантам . Иммуногенность композиций порина и адъювантов (Фрейнда) не превышала этот показатель самого порина [14] или была ниже (для геля гидроокиси алюминия) [8]. Авторы указанных работ не объясняют механизм данного явления, по-видимому, это связано с выраженными гидрофобными свойствами поринов, способных самостоятельно формировать антигенные депо в месте их введения.

Способность поринов индуцировать иммунитет, защищающий от аэрогенного заражения. И.С. Тартаковский и соавт. (1993) показали в сравнительном аспекте защитный эффект иммунизации порином и другими антигенами L. pneumophilla при аэрогенном заражении морских свинок возбудителем легионеллеза [10]. Сходные результаты получили Н. Е. Gilleland et al. (1988). Преимущества белка F (порин P. aeruginosa) как «кандидата» в вакцины для профилактики хронической псевдомонозной легочной инфекции они обосновывали тем, что в результате перехода шероховатой формы P. aeruginosa в гладкую при колонизации легочной ткани возбудитель утрачивал О-антиген, стимулирующий специфический иммунитет, и начинал продуцировать альгинат (главный компонент мукоидного секрета). Вместе с тем антитела к белку F оказывали бактерицидное действие не только на шероховатую форму возбудителя, но и после его перехода в гладкую. Альгинат в аналогичных экспериментах при использовании его в качестве антигена в составе вакцины не обладал достаточной защитной эффективностью [15].

Протективные свойства сыворотки к пориновому белку оказались высокими в отношении возбудителей, к которым они были получены. При инфицировании мышей, которым предварительно вводили кроличью иммунную сыворотку, возбудителем синегнойной инфекции в дозе ЗLD ₅₀ клеток выживало до 90% животных [15]. Индекс защиты при экспериментальной инфекции мышей, вызванной S. typhimurium, достигал 47,5, эта величина в 20–30 раз выше, чем в опытах, при использовании сыворотки интактных кроликов [23]. Введение морским свинкам и кроликам сыворотки, специфичной к поринам Shigella flexneri и Shigella zonnei, защищало животных от кератоконъюнктивита, вызванного негомологичными штаммами данных возбудителей [12].

Протективные свойства поринов и других бактериальных антигенов . В большинстве работ, посвященных протективным свойствам порообразующих белков бактерий, указывается на их преимущества перед вакцинами на основе убитых клеток, капсульного антигена и ЛПС-комплекса (табл.). Н.Е. Gilleland et al. (1993) на модели хронической легочной инфекции у крыс, вызываемой P. aeruginosa, сравнили протективные свойства хорошо изученных антигенов (их сочетаний) и порина [16]. Авторы определили протективность 8 вакцинных препаратов, содержащих белок F наружной мембраны, эластазу, токсоид экзотоксина А при применении каждого компонента в отдельности и в разных сочетаниях. Для этого крыс иммунизировали внутримышечно с 2-недельными интервалами и на 42-й день брали кровь для установления титра IgG. Одновременно животных интратрахеально заражали клиническими штаммами P. aeruginosa. На 49-й день крыс убивали, а легочную ткань исследовали на наличие повреждений, вызываемых Р. aeruginosa. Значимым протективным эффектом обладал только белок F, эластаза оказывала лишь небольшое протективное действие против обширных повреждений легочной ткани. Комбинация белка F с эластазой также не была результативной, а защитный эффект трехкомпонентной вакцины (белок F, эластаза, токсоид экзотоксина А) не превышал действие одного белка F [16].

Использование пориновых белков для профилактики инфекционных болезней у сельскохозяйственных животных . Конструирование химических вакцин на основе порообразующих белков целесообразно в отношении тех возбудителей, против которых ранее не удавалось разработать вакцины на основе других антигенов (возбудители сапа, мелиоидоза, некробактериоза, дизентерии). Кроме этого существует группа болезней, вакцины против которых защищают только от возбудителей определенных серотипов (листериоз, кампилобактериоз, псевдотуберкулез, сальмонеллез, псевдомоноз). Исходя из способности порообразующих белков индуцировать иммунитет, эффективно защищающий от аэрогенного заражения, целесообразно разрабатывать аналогичные вакцины в отношении возбудителей инфекционных болезней, поражающих животных преимущественно этим путем (пастереллез, гемофилезная плевропневмония и гемофилезный полисерозит свиней).

Подходы к конструированию химических вакцин на основе поринов. Учитывая более высокую иммуногенность поринов по сравнению с другими антигенами бактериальных клеток, а также их способность вызывать видоспецифический иммунитет, разработчики вакцин должны стремиться к максимальной очистке порообразующих белков от фрагментов капсульного полимера, нуклеиновых кислот, других мембранных белков и липополисахаридного комплекса. Однако полностью удалять полисахариды из препарата не следует, так как их следовые количества стабилизируют третичную и четвертичную структуру порина [5, 24]. По данным Н.Е. Gilleland et al. (1988), композиции поринов с другими клеточными антигенами, адьювантами, живыми ослабленными или убитыми микроорганизмами малоэффективны. Нецелесообразно конъюгировать порины с высокоиммуногенными белковыми носителями (бычий сывороточный альбумин, анатоксин столбняка и др.). Специалисты канадской фирмы Connaught Laboratories Limited [6] для повышения иммуногенности гемофилезной вакцины использовали полимеризованные макромолекулярные агрегаты порина Р2 HiB, тем самым увеличивая плотность эпитопов на одну молекулу антигена. Для достижения аналогичной цели можно применить полимеризацию белковых антигенов с помощью глутарового альдегида [22].

Правовая сторона конструирования вакцин на основе поринов заключается в том, что ряд крупных организаций (Behringverke AG, ФРГ; Connaught Laboratories Limited, Канада; Board of Regent The University of Texas System, США и др.) патентуют свои разработки по пориновым белкам в промышленно развитых странах [2, 3, 4, 6, 7]. Поэтому, перед тем как приступить к созданию иммуногенных или иных препаратов на основе поринов, необходимо убедиться в том, что на территории Российской Федерации или тех государств, куда предполагается экспорт их, не действуют патенты, защищающие интересы других организаций и частных лиц. Особую осторожность необходимо проявлять в отношении вакцин против возбудителей массовых болезней животных. Запатентованные отечественным разработчиком препараты, содержащие порины, могут быть им легко, идентифицированы по единственному признаку — способности формировать поры в бислойных липидных мембранах. Это значительно облегчает контроль за соблюдением собственного исключительного права на использование препарата, содержащего порин.

Заключение. Порообразующие белки имеют преимущества перед другими клеточными антигенами бактерий: высокую иммуногенность и видоспецифичность приобретаемого животным иммунитета, преобладание клеточного звена в иммунном ответе (что особенно важно для профилактики болезней, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами), способность защищать от аэрогенного заражения, нет необходимости использовать адъюванты. Хорошим защитным действием обладают и сыворотки, полученные к пориновым белкам. Ученые из группы Н. Barley из Worcester Foundation for Experimental Biology (США) утверждают, что изучение свойств поринов положит начало новым биологическим и медицинским технологиям [13].

ЛИТЕРАТУРА

1. Грязнова Н. С, Субботина Н. А. //Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34. № 12.

2. Заявка 5060605, МКИ А 61 К 35/74/ Супотницкий М.В., Кузнецов С.М., Полевщиков С. Н. и др.; НИИМ МО РФ (Россия).

3. Заявка 92-006762, МКИ А 61 К 39/00/ Супотницкий М.В., Маслов А.В., Сероглазое В.В. и др.; НИИМ МО РФ (Россия).

4. Заявка OS 3718591. МКИ C12N1/20/ Веhringwerke A.G. (ФРГ).

5. Новикова О. Д. Автореф. дис. ...канд. биол. наук.— Владивосток. 1986.

6. Патент 93/15205, МКИ C12N15/00/ Connaught Laboratories Limited (Канада).

7. Патент 6320289, МКИ C12N15/00/ Board of Regents the University of Texas System (США).

8. Супотницкий M.В. и др.// Ветеринария. 1995. № 3.

9. Супотницкий М.В. и др. // Иммунология и специфическая профилактика особоопасных инфекций.— Саратов. 1993.

10. Тартаковский И.С. и др. // Иммунология и специфическая профилактика особоопасных инфекций.— Саратов. 1993.

11. Эпизоотология и инфекционные болезни // А.А. Конопаткин, Б.Т. Артемов, И.А. Бакулов и др.— М. 1993.

12. Adamus G. et al. // Infect. Immun. 1980. 30. 2.

13. Amato J. // Science. 1992. 255. 5045.

14. Gilleland H. E. et al. // Infect. Immun. 1984. 44. 1.

15. Gilleland H. E et al. // Infect. Immun. 1988. 56. 5.

16. Gilleland H. E et al. // J. Med. Microbiol. 1993. 38. 2.

17. Gilig P. A. et al. // Intect. Immun. 1989. 37. 1.

18. Hansen E. J. et al. // Infect. Immun. 1981. 32. 3.

19. Hansen E. J. at al. // Infect. Immun. 1989. 57. 11.

20. Hancock R. E W. et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. 136. 1.

21. Heckels J. E. et al. // J. Gen. Microbiol. 1989. 135. B.

22. Jolh/et M. et al. // Vaccine. 1990. 8. 2.

23. Kuunsi N. et al. // Infect. Immun. 1979. 25. 3.

24. Kuusi N. et al. // Infect. Immun. 1981. 34. 2.

25. Matsui K., Arai T. // Jap. J. Bacteriol. 1989. 44.1.

26. Matsui K., Arai T. // Microbiol. and Immunol.1989. 33. 9.

27. Matsui K., Arai T. // Microbiol. andImmunol. 1990. 34. 11.

28. Robertson S. et al. //Infect. Immun. 1989. 36. 1.

29. Saukkonen K. et al.// Vaccine. 1989. 7. 2.

30. Zak K. et al. // J. Infect.Dis. 1989. 149. 1.

31. Zollinger W. O. et al. // J.Infect. Dis. 1978. 137. 6.

Супотницкий М.В. Порообразующие белки — иммуногенные компоненты ветеринарных вакцин // Ветеринария. – 1996. - № 4. – С. 19-24

Продолжение темы смотрите в статьях "ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОРООБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ", "ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"; патентах №2052993, № 2059413, № 92006762; и в книге " Микроорганизмы, токсины и эпидемии"