2059413
(13) Вид документа	C1
(14) Дата публикации	1996.05.10
(19) Страна публикации	RU
(21) Регистрационный номер заявки	5060605/13
(22) Дата подачи заявки	1992.08.28
(46) Дата публикации формулы изобретения	1996.05.10
(516) Номер редакции МПК	6
(51) Основной индекс МПК	A61K39/02
(51) Основной индекс МПК	A61K35/74
Название	СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ САПА У ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
(56) Аналоги изобретения	В.Томеску, И.Гаврилэ, Д.Гаврилэ. Зоонозы, М.: Колос, 1982, с.115.
(71) Имя заявителя	Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации
(72) Имя изобретателя	Супотницкий М.В.
(72) Имя изобретателя	Кузнецов С.М.
(72) Имя изобретателя	Полевщиков С.Н.
(72) Имя изобретателя	Желнина Т.Б.
(73) Имя патентообладателя	Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерац

Реферат

Использование: медицина, специфическое лечение сапа, предотвращение развития у млекопитающих заболевания сапом. Сущность изобретения: белок, выполняющий порообразующую функцию в клеточных стенках Pseudomonas mallei, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, с молекулярной массой 37 - 40 кД, вводят подкожно чувствительным к сапу животным из расчета 100 - 30000 мкг белка на 1 кг массы животного. Через 12 - 24 ч введение белка повторяют. Лечение осуществляют как минимум в течение двух суток после заражения или до исчезновения клинических проявлений заболевания при развившейся сапной инфекции. Способ обеспечивает 100% выживание золотистых хомячков, зараженных подкожно 10 - 20 смертельными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма P. mallei и 52% золотистых хомяков с развившейся сапной инфекцией при 100%-ной гибели нелеченных животных. 2 табл.

RU 2059413

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

к патенту Российской Федерации

(21) 5060605/13

(22) 28.08.92

(46) 10.05.96 Бюл. № 13

(72) Супотницкий М.В., Кузнецов С.М., Полевщиков С.Н., Желнина Т.Б.

(54) СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ САПА У ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфического лечения, и может быть использовано для предотвращения развития у млекопитающих заболевания сапом.

Задачей изобретения является блокирование проникновения P. mallei в клетки млекопитающих.

Решение задачи достигается путем введения чувствительным к возбудителю сапа млекопитающим белков, выполняющих порообразующую функцию в клеточных стенках сапного микроба.

Изобретение основано на впервые обнаруженной авторами способности пориновых белков из P. mallei останавливать развитие сапной инфекции.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Пориновые белки, очищенные от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к сапу животным (в наших опытах — золотистые хомячки) из расчета 100–30000 мкг белка на кг массы животного. Через 12-24 ч введение белка повторяют. Лечение осуществляют как минимум в течение 2-х суток после заражения или до исчезновения клинических признаков заболевания (при развившейся сапной инфекции). Для определения протективного эффекта выполняют подкожное заражение животных вирулентной культурой P. mallei в количествах, достаточных для их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. При заражении культурой вирулентного штамма P. mallei выживаемость животных зависит от дозы и кратности введения препарата. Способ обеспечивал выживание до 100% золотистых хомяков, зараженных подкожно 10-20 смертельными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма P. mallei. Ц-5.

Существенным признаком заявляемого изобретения является использование в качестве лечебного средства белка, выполняющего порообразующую функцию в клеточных стенках возбудителя сапа. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно — избирательное связывание введенных млекопитающему поринов со специфическими рецепторами, узнаваемыми P. mallei на поверхности эукариотических клеток, приводит к нарушению адгезии бактерий к наружной части плазматической мембраны клеток эукариот. В результате происходит нарушение процесса проникновения бактерий во внутрь клеток млекопитающих, что вызывает их гибель и предотвращает развитие инфекционного процесса.

Препараты пориновых белков, выделенные из возбудителя сапа, не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомяков в дозах 30 мг/кг массы животного. Обнаружение способности у пориновых белков, выделенных из клеток возбудителей сапа, предотвращать и излечивать заболевание, вызываемое P. mallei, позволяет их использовать для экстренной специфической профилактики и лечения данного заболевания и в частности вызываемого антибиотикоустойчивыми штаммами P. mallei.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Выделение поринового белка из культуры штамма P. mallei Ц-5

Для выделения поринового белка использовался способ, разработанный Новиковой О.Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yerslnla pseudotuberculosls. Химическая характеристика и биологическая активность: Дис. канд. биол. наук. - Владивосток, 1986). Способ заключается в следующем. К 6 г ацетон-высушенных клеток возбудителя сапа добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 ч клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре 4±2°С. Затем их охлаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют с 200 мл 0,03 М трис-HCI буфера (рН 7,2) (далее - буфер А), содержащего 2% тритона X-100, и экстрагируют при температуре 4±2°С в течение 2 ч при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1М раствора MgCI и 10 мг ДНК-азы (Реахим НПО «Биохимрсактив») и инкубируют 12 ч.

Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия и экстрагируют при температуре 60±1°С в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 ч.

Осадок промывают водой, растворяют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCI, выдерживают при температуре 37±0,5°С в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин.

Пептидогликан отделяют центрифугированием. Разделение белков ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Выделенный препарат представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37-40 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю сапа образует одну четкую линию.

За принадлежность выделенного белка к белкам класса поринов говорит следующее: метод выделения Новиковой О.Д. может быть использован только для выделения порообразующих белков, локализованых в наружной мембране и тесно связанных с липополисахаридами; белок проявляет выраженные гидрофобные свойства и нерастворим в воде; он обладает способностью индуцировать выраженный видоспецифический иммунитет; молекулярная масса мономера 37-40 кД, что у мембранных белков характерно только для поринов.

Пример 2. Определение протективного эффекта для золотистых хомяков

Выбор золотистых хомяков для опытов по оценке протективного эффекта порина из Р. mallei обусловлен их очень высокой чувствительностью к данному возбудителю.

Опыт 1. Доказательство способности порина P. mallei предотвращать заболевание сапом.

Условия выполнения опыта и его результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Доказательство способности порина P. mallei предотвращать заболевание сапом

Схема применения препарата, дни после заражения Ц-5	Микроорганизм, из которого выделен порин	Количество препарата на одно введение, мкг	Животные
			всего в опыте	из них пало	% павших
1	P. mallei	100	9	9	100
1, 2	тоже	100	9	1	13
2, 3, 4, 5	тоже	100	9	9	100
1, 2, 3	тоже	100	9	2	26
1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9	тоже	100	9	1	13
1, 2, 3, 4. 5, 8	тоже	350	7	0	0
1, 2, 3, 4, 5	P. pseudomallei	100	9	9	100
Контроль	–	–	9	9	100

Примечание:

1. Заражение проводилось подкожно, животным введено по 10-20 смертельных доз возбудителя сапа (90-180 клеток);

2. 1-й день - день заражения;

3. Порин вводили один раз в сутки подкожно.

Данные, приведенные в табл. 1. показывают высокий защитный эффект порина, выделенного из P. mallei. Отсутствие протективного эффекта у порина, выделенного из возбудителя мелиоидоза, свидетельствует о специфичности протективного действия пориновых белков. Интерес представляет и тот факт, что 100%-ная гибель животных происходит только в тех случаях, когда порин введен либо в 1-е сутки, либо через сутки. Число павших животных резко уменьшается, если порин вводят в течение первых двух суток. По-видимому, продолжительность связывания поринами сайтов на поверхности клеток макроорганизма, необходимых для узнавания, не превышает одних суток, в то же время циркулирование возбудителя заболевания в крови золотистых хомяков при отсутствии условий для проникновения внутрь клеток (персистирования) не превышает двух суток. Очевидна и зависимость лечебного эффекта от дозы вводимого препарата.

Опыт 2. Доказательство специфического лечебного действия порина, выделенного из P. mallei.

Условия выполнения опыта и его результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Доказательство специфического лечебного действия порина выделенного из P. mallei

Серия №№	Схема применения препарата, дни после заражения	Микроорганизм, из которого выделен порин	Животные
			всего в опыте	из них пало	% павших
1	5,7, 8, 9, 12	P. mallei	9	5	52
2	5, 7, 8	P. pseudomallei	6	6	100
3	5, 7, 8	P. aeruglnosa	6	5	82
4	5, 7, 8	S. typhlmurlum	6	6	100
5	Контроль	то же	9	9	100

Примечание. Лечение начато в тот же день, когда погибли первые животные (включены в число павших) и продолжалось либо до исчезновения симптомов заболевания (серия 1), либо до гибели всех животных серии. Заболевшим животным ежедневно вводили 100 мкг препарата (по белку). Остальные условия приведены в табл. 1.

Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что возможно специфическое блокирование развития сапной инфекции пориновым белком, выделенным из P. mallei. Практически 100%-ная гибель больных животных, леченных поринами из близкородственных микроорганизмов (возбудители мелиоидоза и псевдомоноза), а также S. typhlmurlum, свидетельствует о специфическом лечебном действии порина P. mallei.

 

Формула изобретения

СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ САПА У ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ путем введения лечебного препарата, отличающийся тем, что в качестве лечебного препарата используют пориновый белок с мол. м. 37-40 кД. выделенный из пептидогликанового комплекса бактерий Pseudomonas mallei, при этом введение осуществляют по крайней мере в течение двух суток после заражения или до исчезновения клинических признаков заболевания, если лечение начато при развившейся сапной инфекции.

Более подробно о протективных свойствах пориновых белков бактерий смотрите в статьях "ПОРООБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ — ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВЕТЕРИНАРНЫХ ВАКЦИН", "ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ" и "ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОРООБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ"