(13) Вид документа	C1
(14) Дата публикации	1996.01.27
(19) Страна публикации	RU
(21) Регистрационный номер заявки	5066818/14
(22) Дата подачи заявки	1992.08.28
(46) Дата публикации формулы изобретения	1996.01.27
(516) Номер редакции МПК	6
(51) Основной индекс МПК	A61K38/05
(52) Дополнительные индексы МПК	A61K39/00
Название	СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ САПА
(56) Аналоги изобретения	Кравченко А.Т. Сап. Многотомное руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии информационных болезней, М., 1966, т.УП, с.343 - 344.
(71) Имя заявителя	Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ
(72) Имя изобретателя	Супотницкий М.В.
(72) Имя изобретателя	Левчук Б.А.
(72) Имя изобретателя	Бакулин М.К.
(72) Имя изобретателя	Новикова О.Д.
(73) Имя патентообладателя	Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ

Реферат

Использование: медицина для предотвращения заболевания сапом у чувствительных к P. mallei млекопитающих. Сущность изобретения: белок с молекулярной массой 37 - 40 кД, выделенный из наружной клеточной стенки сапного микроба и предположительно выполняющий функцию порообразования, вводят подкожно чувствительным к сапу млекопитающим из расчета 10 - 30000 мг на кг массы. Через 12 - 27 сут иммунизацию повторяют. Способ обеспечил выживание 83% золотистых хомячков, зараженных подкожно 50 - 100 смертельными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма. 2 табл.

RU 2052993

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

к патенту Российской Федерации

(21) 5066818/14

(22) 28.08.92

(46) 27.01.96 Бюл. № 3

(72)Супотницкий М.В., Левчук Б.А., Бакулин М.К., Новикова О.Д.

(54) СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ САПА

Изобретение относится к медицине, в частности к способам профилактики инфекционных заболеваний, и может быть использовано для предотвращения заболевания сапом у чувствительных к P. mallei млекопитающих.

Против сапа не разработаны методы специфической профилактики. Работа с этим возбудителем ведется в условиях обязательной механической защиты глаз, рук и дыхательных путей. Заболевших животных, как правило, убивают, трупы сжигают.

Наиболее близким к заявляемому является способ, заключающийся в воздействии антибактериальных препаратов (сульфаниламидов и(или) антибиотиков) на организм, инфицированный возбудителем сапа (или подвергшийся риску инфицирования). Способ применяется исключительно для личной профилактики лиц, попавших в аварии [1].

Недостатком данного способа является неспецифичность действия используемых для профилактики сапа медикаментов. В результате этого профилактические мероприятия носят нецеленаправленный характер и могут осуществляться только после контакта человека с возбудителем сапа, в случаях, когда об этом стало известно представителям медицинской службы. Вследствие своей неспецифичности способ не может быть использован для широкомасштабной профилактики сапа у животных.

Целью изобретения является создание у млекопитающих специфической устойчивости к заражению P.mallei.

Цель достигается за счет воздействия на чувствительных к возбудителю сапа млекопитающих белками с молекулярной массой 37-40 кД, выделенными из клеточной стенки возбудителя сапа.

Изобретение основано на впервые обнаруженной способности данного белка возбудителя сапа оказывать протективное действие в отношении сапной инфекции.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Белок с молекулярной массой 37-40 кД, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к сапу животным (золотистым хомячкам) из расчета 10-30000 мг антигена на кг массы. Через 12-27 сут иммунизацию повторяют. Для определения протективного эффекта выполняют подкожное или аэрогенное заражение животных вирулентной культурой P. mallei в количествах, достаточных для вызывания их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. Протективный эффект определяют как отношение LD₅₀вирулентного штамма для вакцинированных животных к LD₅₀ для интактных (индекс резистентности). При заражении культурой вирулентного штамма P. mallei индекс резистентности зависит от дозы и кратности введения препарата. Способ обеспечивал выживание 83% золотистых хомячков, зараженных подкожно 50-100 смертельными инфицирующими дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма P. mallei Ц-5.

Существенным признаком заявляемого изобретения является то, что белок с молекулярной массой 37-40 кД, выделенный из наружной мембраны клеточной стенки возбудителя сапа, обладает выраженным иммунопротективным эффектом, который связан с тем, что основной функцией данного белка в клеточной стенке является образование пор для низкомолекулярных веществ. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно - избирательное связывание антител, выработанных иммунной системой макроорганизма на данный белок, с белками - поринами, образующими на поверхности бактериальной стенки каналы для прохождения низкомолекулярных веществ, ведет к нарушению нормального метаболизма бактерий, что в коническом итоге и является причиной их гибели.

Другим возможным механизмом предотвращения инфекционного процесса может быть стимулирование специфического клеточного иммунитета за счет облегчения узнавания иммунной системой (клетками, выполняющими киллерную функцию) возбудителя сапа. Немаловажным в прояснении механизмов развития протективного эффекта, достигаемого данным способом, является и то обстоятельство, что у некоторых бактерий порины выполняют роль одного из факторов патогенности, способствуя их проникновению в клетки млекопитающих. Возбудитель сапа является внутриклеточным паразитом, поэтому любое взаимодействие антител с его поверхностными белками, а с поринами особенно, приводит к нарушению адгезии этого возбудителя на поверхностях клеток-мишеней.

Препараты мембранного белка с молекулярной массой 37-40 кД не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомячков в дозах 30 мг/кг массы животного. Обнаружение способности у данного белка индуцировать специфический иммунитет позволяет использовать его для создания эффективной химической вакцины против сапа.

Пример 1. Выделение поринового белка из культуры штамма P. mallei Ц-5

Для выделения поринового белка использовался способ, разработанный Новиковой О.Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yerslnla pseudotuberculosls. Химическая характеристика и биологическая активность: Дис. канд. биол. наук. - Владивосток, 1986). Способ заключается в следующем. К 6 г ацетон-высушенных клеток возбудителя сапа добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 ч клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре 4±2°С. Затем их охлаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют с 200 мл 0,03 М трис-HCI буфера (рН 7,2) (далее - буфер А), содержащего 2% тритона X-100, и экстрагируют при температуре 4±2°С в течение 2 ч при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1М раствора MgCI и 10 мг ДНК-азы (Реахим НПО «Биохимрсактив») и инкубируют 12 ч.

Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия и экстрагируют при температуре 60±1°С в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 ч.

Осадок промывают водой, растворяют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCI, выдерживают при температуре 37±0,5°С в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин.

Пептидогликан отделяют центрифугированием. Разделение белков ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Выделенный препарат представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37-40 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю сапа образует одну четкую линию.

За принадлежность выделенного белка к белкам класса поринов говорит следующее: метод выделения Новиковой О.Д. может быть использован только для выделения порообразующих белков, локализованых в наружной мембране и тесно связанных с липополисахаридами; белок проявляет выраженные гидрофобные свойства и нерастворим в воде; он обладает способностью индуцировать выраженный видоспецифический иммунитет; молекулярная масса мономера 37-40 кД, что у мембранных белков характерно только для поринов.

Пример 2. Определение протективного эффекта для золотистых хомячков

Выбор золотистых хомячков для опыта по оценке протективного эффекта порина из P.mallei обусловлен их высокой чувствительностью к данному возбудителю.

Опыт 1. Для определения специфического протективного эффекта порина, животных вакцинировали подкожно дважды с интервалом 21 сут. Доза для каждого введения 25 мг антигена (по белку) на животное (вес животных 100 г). Через 18 сут после повторной вакцинации животных заражали подкожно двухсуточной агаровой культурой штамма P. mallei 5584. В качестве контроля использовались интактные животные. Результаты опыта приведены в табл.1.

Таблица 1

Определение протективного эффекта, получаемого заявленным изобретением при экспериментальном сапе золотистых хомячков

Схема вакцинации, доза антигена	Заражающая доза, микробных клеток	Животные		Индекс защиты
		всего в опыте	из них пало
Двукратная вакцинация, по 25 мкг антигена на животное	6	6	0	18,1
	12	6	0
	25	6	0
Двукратная вакцинация, по 25 мкг антигена на животное	50	6	2	18,1
	100	6	4
	200	6	5
Контроль	6	6	5	1,0
	12	6	5
	25	6	6
	50	6	6
	100	6	6
	200	6	6

Опыт 2. Для изучения возможности повышения защитного действия порина иммунизацию проводили с различными дозами и кратностью введения препарата. Условия проведения опыта и полученные результаты приведены в табл. 2. Заражение животных выполняли, как описано в опыте 1.

Таблица 2

Результаты оценки протективного эффекта различных схем иммунизации при экспериментальном сапе золотистых хомячков

Количество введенного антигена на одно животное, мг	Заражающая доза, микробных клеток	Животные		% павших
		всего в опыте	из них пало
3.0; 0.2; 0,2	500	6	1	17
1,0; 0,2; 0.2	500	6	1	17
0.2; 0.2; 0.2	500	6	2	33
0,2; 0,2	500	15	10	67
Контроль	500	6	6	100

Примечания:

1. Ревакцинацию проводили с интервалами в 20 дней, заражение через 5 сут после последней иммунизации.

2. Животных заражали 50-100 смертельными дозами возбудителя сапа (штамм Ц-5)

Формула изобретения

СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ САПА, включающий воздействие на организм медикоментозным средством, отличающийся тем, что воздействие осуществляют выделенными из клеточной стенки сапного микроба белками с мол. м. 37-40 кД, которые выполняют роль видоспецифического антигена, и индуцируют при иммунизации у животных видоспецифический иммунитет к возбудителю сапа.

Более подробно о протективных свойствах пориновых белков бактерий смотрите в статьях "ПОРООБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ — ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВЕТЕРИНАРНЫХ ВАКЦИН", "ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ" и "ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОРООБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ"