(11) Номер публикации	2065308
(13) Вид документа	A
(14) Дата публикации	1996.06.10
(19) Страна публикации	RU
(21) Регистрационный номер заявки	92006762/13
(22) Дата подачи заявки	1992.11.17
(43) Дата публикации заявки	1996.06.10
(516) Номер редакции МПК	6
(51) Основной индекс МПК	A61K39/02
Название	СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ МЕЛИОИДОЗА
(71) Имя заявителя	Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны РФ
(72) Имя изобретателя	Супотницкий М.В.
(72) Имя изобретателя	Маслов А.В.
(72) Имя изобретателя	Сероглазов В.В.
(72) Имя изобретателя	Кожухов В.В.

 

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфической профилактики инфекционных заболеваний, и может быть использовано для предотвращения заболевания мелиоидозом у чувствительных к P.pseudomallei млекопитающих. Сущность предложенного способа заключается в следующем. Белок, выполняющий порообразующую функцию в клеточной стенке P.pseudomallei, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к мелиоидозу животным из расчета 880-7000 мкг на кг массы животного. Иммунизацию повторяют по схеме, экспериментально подобранной для каждого вида животных. Определение протективного эффекта проводят подкожным заражением животных вирулентной культурой мелиоидозного микроба. Способ обеспечил 100% выживание белых крыс, зараженных подкожно 3О LD₅₀ агаровой культуры высоковирулентного штамма P.pseudomallei C -141.

RU 2065308

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

к патенту Российской Федерации

(21) 92006762/13

(22) 17.11.92

(46) 20.08.96 Бюл. № 23

(72) Супотницкий М.В., Маслов А.В., Сероглазов В.В., Кожухов В.В.

(54) СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ МЕЛИОИДОЗА

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфической профилактики инфекционных заболеваний и может быть использовано для предотвращения заболевания мелиоидозом чувствительных к Pseudomonas pseudomallei млекопитающих.

Аналоги не известны.

Задачей изобретения является создание у млекопитающих специфической устойчивости к заражению P. pseudomallei.

Решение задачи достигается иммунизацией млекопитающих белком, выполняющим порообразующую функцию клеточной стенке возбудителя данного заболевания.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. Пориновый белок, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к мелиоидозу животным (в наших опытах — золотистые хомячки и белые крысы) из расчета 880–7000 мкг антигена на кг массы животного. При необходимости иммунизацию повторяют. Определение протективного эффекта выполняют подкожным заражением животных клетками вирулентной культуры P. pseudonallei в количествах, достаточных для вызывания их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. Протективный эффект (индекс резистентности) определяют как отношение LD₅₀ вирулентного штамма для вакцинированных животных, к LD₅₀ для интактных животных. Индекс резистентности зависит от дозы и кратности введения препарата. Схема иммунизации экспериментально подбирается для каждого вида животных. Способ обеспечивает выживание 100% белых крыс, зараженных подкожно 30 LD₅₀ агаровой культуры высоковирулентного штамма Р. pseudomallei C-141.

Существенным признаком заявляемого изобретения является использование для иммунизации чувствительных к мелиоидозу животных белка, выполняющего порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя мелиоидоза. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, заключающаяся в том, что антитела, выработанные иммунной системой макроорганизма на пориновые белки, связываются с поринами, образующими на поверхности бактериальной клетки поры, и нарушают проницаемость бактериальной стенки для низкомолекулярных веществ. В результате происходит нарушение нормального метаболизма бактерий, что в конечном итоге и является причиной их гибели.

Другим возможным механизмом предотвращения инфекционного процесса может быть стимулирование специфического клеточного иммунитета.

Препараты поринового белка, выделенные из возбудителя мелиоидоза, не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомяков и белых крыс в дозах до 70 мг/кг массы животного (максимальная доза их использования). Способность поринового белка мелиоидозного микроба индуцировать специфический иммунитет у млекопитающих впервые обнаружена авторами данного способа.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Выделение поринового белка из культуры штамма P. pseudomallei C-141

Для выделения поринового белка использовался способ, разработанный Новиковой О.Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. Химическая характеристика и биологическая активность. Дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1986). Способ заключается в следующем. К 6 г ацетонвы-сушенных клеток возбудители мелиоидоза добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 час клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре (4±2°С. Затем их осаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют в 200 мл 0,03 М трис-HCl буфера (рН 7,2) (далее — буфер А), содержащего 2% тритона Х-100, и экстрагируют цитоплазматические белки при температуре (4±2°С в течение 2 час при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1 М раствора MgCl 2 и 10 мг ДНК-азы (Реахим НПО "Биохимреактив") и инкубируют 12 час.

Затем осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и инкубируют при температуре (60±1)°С в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 час.

Осадок промывают водой, растворяют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCI, выдерживают при температуре 37±0,5°С в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин.

Пептидогликан отделяют центрифугированием. Далее очистку порина (остается в супернатанте) ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Порин из Р. pseudomallei представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37–38 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю мелиоидоза образует одну четкую линию. Очищенный препарат используется для иммунизации животных.

Пример 2. Доказательство возможности получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков

Выбор золотистых хомяков обусловлен их очень высокой чувствительностью к данному возбудителю. Условия опыта и полученные результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Определение протективных свойств поринового белка из клеток P. pseudomallel при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков

Доза водимого препарата мкг/животное	Кратность введения препарата	Дозе заражения, микробных клеток	Количество животных			Величина LD50 микробных клеток	Индекс защиты	Величина ED50 препарата (мкг) при дозе заражения, LD50
			в опыте	пало	выжило			8,5	42
87,5	1	0,4	4	0	4	2,5	12,5
	1	1.7	4	2	2
	1	8,4	3	2	1
	1	42,0	3	3	0
175,0	1	0.4	4	0	4	2,5	12,5
	1	1.7	4	2	2
	1	8,4	4	3	1
	1	42,0	4	4	0
350,0	1	0.4	4	0	4	3.7	18,5	124	292
	1	1.7	4	0	4
	1	8,4	3	3	0
	1	42,0	3	3	0
700,0	1	0,4	4	•о	4	5,6	28.0
	1	1.7	4	0	4
	1	8.4	4	3	1
	1	42.0	4	4	0
Контроль (неиммунизированные)	–	0.4	4	2	2	0,2	–
	–	1.7	4	3	1
	–	8,4	3	3	0
	–	42.0	3	3	0

Примечания:

1. Заражение осуществлялось подкожно, через 14 сут после иммунизации.

2. ЕD₅₀ -количество препарата, защищающее 50% животных, взятых в опыт.

Результаты, представленные в табл. 1, доказывают принципиальную возможность получения по заявленному способу протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков.

Пример 3. Доказательство возможности получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе белых крыс

Выбор белых крыс в качестве экспериментальной модели при мелиоидозе обусловлен их сравнительно низкой чувствительностью к возбудителю, сопоставимыми с таковыми у человека показателями клеточного и гуморального иммунитета по бактерицидным свойствам сыворотки крови и гиперчувствительности замедленного типа. Схема опыта и его результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Протективный эффект иммунизации пориновыми белками P. pseudomallel при экспериментальном мелиоидозе белых крыс

Схема иммунизации, доза антигена	Заражающая доза микробных клеток	Количество животных			Эффективность, %
		в опыте	пало	выжило
Однократная иммунизация по 350 мкг на животное	30х106	5	5	0	0
Двукратная иммунизация по 150 мкг на животное	30х106	5	0	5	100
Трехкратная иммунизация по 150 мкг на животное	30х106	4	0	4	100
Контроль (неиммунизи-рованные)	30х106	3	3	0	–

Примечания:

1. Ревакцинацию проводили с интервалами в 14 сут, заражение через 10 сут послепоследней иммунизации.

2. Заражающая доза соответствует 30 LD₅₀ для данного вида животных.

3. Заражение и иммунизация осуществлялись подкожным введением препаратов.

Результаты опытов, приведенные в табл. 2, доказывают принципиальную возможность получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе белых крыс после двукратной иммунизации пориновым белком.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ специфической профилактики мелиоидоза, включающий иммунизацию чувствительных к мелиоидозу животных антигеном из клеточной стенки возбудителя, отличающийся тем, что иммунизируют белком, выполняющим порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя данного заболевания.

Более подробно о протективных свойствах пориновых белков бактерий смотрите в статьях "ПОРООБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ — ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВЕТЕРИНАРНЫХ ВАКЦИН", "ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ" и "ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОРООБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ"