Способ специфической профилактики мелиоидоза, патент № 2065308

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфической профилактики инфекционных заболеваний, и может быть использовано для предотвращения заболевания мелиоидозом у чувствительных к P.pseudomallei млекопитающих. Сущность предложенного способа заключается в следующем. Белок, выполняющий порообразующую функцию в клеточной стенке P.pseudomallei, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к мелиоидозу животным из расчета 880-7000 мкг на кг массы животного. Иммунизацию повторяют по схеме, экспериментально подобранной для каждого вида животных. Определение протективного эффекта проводят подкожным заражением животных вирулентной культурой мелиоидозного микроба. Способ обеспечил 100% выживание белых крыс, зараженных подкожно 3О LD50 агаровой культуры высоковирулентного штамма P.pseudomallei C -141. RU 2065308 Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к патенту Российской Федерации (21) 92006762/13 (22) 17.11.92 (46) 20.08.96 Бюл. № 23 (72) Супотницкий М.В., Маслов А.В., Сероглазов В.В., Кожухов В.В. (54) СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ МЕЛИОИДОЗА Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфической профилактики инфекционных заболеваний и может быть использовано для предотвращения заболевания мелиоидозом чувствительных к Pseudomonas pseudomallei млекопитающих. Аналоги не известны. Задачей изобретения является создание у млекопитающих специфической устойчивости к заражению P. pseudomallei. Решение задачи достигается иммунизацией млекопитающих белком, выполняющим порообразующую функцию клеточной стенке возбудителя данного заболевания. Сущность предложенного способа заключается в следующем. Пориновый белок, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к мелиоидозу животным (в наших опытах — золотистые хомячки и белые крысы) из расчета 880–7000 мкг антигена на кг массы животного. При необходимости иммунизацию повторяют. Определение протективного эффекта выполняют подкожным заражением животных клетками вирулентной культуры P. pseudonallei в количествах, достаточных для вызывания их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. Протективный эффект (индекс резистентности) определяют как отношение LD50 вирулентного штамма для вакцинированных животных, к LD50 для интактных животных. Индекс резистентности зависит от дозы и кратности введения препарата. Схема иммунизации экспериментально подбирается для каждого вида животных. Способ обеспечивает выживание 100% белых крыс, зараженных подкожно 30 LD50 агаровой культуры высоковирулентного штамма Р. pseudomallei C-141. Существенным признаком заявляемого изобретения является использование для иммунизации чувствительных к мелиоидозу животных белка, выполняющего порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя мелиоидоза. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, заключающаяся в том, что антитела, выработанные иммунной системой макроорганизма на пориновые белки, связываются с поринами, образующими на поверхности бактериальной клетки поры, и нарушают проницаемость бактериальной стенки для низкомолекулярных веществ. В результате происходит нарушение нормального метаболизма бактерий, что в конечном итоге и является причиной их гибели. Другим возможным механизмом предотвращения инфекционного процесса может быть стимулирование специфического клеточного иммунитета. Препараты поринового белка, выделенные из возбудителя мелиоидоза, не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомяков и белых крыс в дозах до 70 мг/кг массы животного (максимальная доза их использования). Способность поринового белка мелиоидозного микроба индуцировать специфический иммунитет у млекопитающих впервые обнаружена авторами данного способа. Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами. Пример 1. Выделение поринового белка из культуры штамма P. pseudomallei C-141 Для выделения поринового белка использовался способ, разработанный Новиковой О.Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. Химическая характеристика и биологическая активность. Дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1986). Способ заключается в следующем. К 6 г ацетонвы-сушенных клеток возбудители мелиоидоза добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 час клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре (4±2°С. Затем их осаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют в 200 мл 0,03 М трис-HCl буфера (рН 7,2) (далее — буфер А), содержащего 2% тритона Х-100, и экстрагируют цитоплазматические белки при температуре (4±2°С в течение 2 час при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1 М раствора MgCl 2 и 10 мг ДНК-азы (Реахим НПО “Биохимреактив”) и инкубируют 12 час. Затем осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и инкубируют при температуре (60±1)°С в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 час. Осадок промывают водой, растворяют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCI, выдерживают при температуре 37±0,5°С в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин. Пептидогликан отделяют центрифугированием. Далее очистку порина (остается в супернатанте) ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Порин из Р. pseudomallei представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37–38 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю мелиоидоза образует одну четкую линию. Очищенный препарат используется для иммунизации животных. Пример 2. Доказательство возможности получения протективного эффекта при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков Выбор золотистых хомяков обусловлен их очень высокой чувствительностью к данному возбудителю. Условия опыта и полученные результаты приведены в табл. 1. Таблица 1 Определение протективных свойств поринового белка из клеток P. pseudomallel при экспериментальном мелиоидозе золотистых хомяков

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ специфической профилактики мелиоидоза, включающий иммунизацию чувствительных к мелиоидозу животных антигеном из клеточной стенки возбудителя, отличающийся тем, что иммунизируют белком, выполняющим порообразующую функцию в клеточной стенке возбудителя данного заболевания. Более подробно о протективных свойствах пориновых белков бактерий смотрите в статьях “ПОРООБРАЗУЮЩИЕ БЕЛКИ - ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВЕТЕРИНАРНЫХ ВАКЦИН”, “ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ” и “ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОРООБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ”

• Мелиоидоз
• Патенты
• Вакцины
• Бактериальные Инфекции
• Пориновые Белки
• Специфическая Профилактика