Современные подходы в области молекулярной генетики вирусов при изучении представителей семейства Coronaviridae

Поступила 01.09.2021 г. Принята к публикации 23.09.2021 г.

Существующие подозрения об искусственном происхождении пандемии COVID-19 и об использовании технологии обратной генетики для создания вируса SARS-CoV-2 требуют понимания ее возможностей в конструировании новых вирусов. Цель работы – показать, каким образом применение обратной генетики позволяет конструировать ранее не существовавшие коронавирусы, технологии и основные достижения в их создании. Для подготовки данной статьи использовалась информация, находящаяся в открытом доступе и легко проверяемая по приведенным источникам. Название технологии – «обратная генетика» произошло из-за того, что при получении способных к размножению РНК-вирусов идут не от ДНК к РНК, как это обычно делается в клетке при синтезе белка, а наоборот, от РНК вируса к комплементарной ей ДНК (кДНК), а с нее с помощью РНК-полимеразы фага Т7 «обратно» к инфекционной РНК. Так как полученная плюс-РНК генома коронавируса имитирует клеточную матричную РНК (мРНК), она немедленно распознается машиной трансляции клетки и запускает формирование собственных инфекционных вирусных частиц. Разработано две системы обратной генетики, предполагающие получение инфекционной плюсРНК – в условиях in vitro и in vivo. Проблема получения полноразмерной кДНК гигантского генома коронавирусов решается путем его фрагментации и последующей сшивкой фрагментов с использованием стандартных подходов молекулярной биологии. В статье приведены примеры, каким образом данная технология позволяет получать синтетические коронавирусы, по свойствам неотличимые от выделенных из природы, менять круг их хозяев, усиливать вирулентность и устойчивость к специфическим антителам, влиять на патогенез болезни. Также показаны перспективы использования рекомбинантных вирусов в клеточных скрининговых анализах и моделях инфекции in vivo для идентификации профилактических и терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций.

Ключевые слова: атипичная пневмония; коронавирус; межвидовая передача; обратная генетика; пандемия; COVID-19; SARS-CoV-2.

Библиографическое описание: Супотницкий М.В. Применение обратной генетики для конструирования ранее не существовавших коронавирусов: технологии и достижения // Вестник войск РХБ защиты. 2021. Т. 5. № 3. С. 217–235. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2021-5-3-217-235

Коронавирусы уже не менее 25 лет являются рутиной генной инженерии. Создание их рекомбинантных производных стало обычным делом в практике двух сотрудничающих/конкурирующих научных школ: Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (University of North Carolina at Chapel Hill, UNC, UNC-Chapel Hill; United States) – руководитель Ральф Стивен Барик (Ralph Steven Baric, 1954 г.р.) [1, 2]; и Уханьского института вирусологии (Wuhan Institute of Virology, WIV; China)¹ – руководитель школы Ши Чжэнли (Zhengli-Li Shi, 1964 г.р.) [3]; Но это не единственные научные школы, экспериментирующие с геномами коронавирусов. В допандемический период исследования по изменению генома коронавирусов проводились открыто, с благородными, публично озвучиваемыми целями²: определить, какой именно белок отвечает за способность коронавирусов переходить от одного биологического вида животных к другому; могут ли они попасть от животных к людям; и могут ли распространятся воздушно-капельным путем между людьми; как создать спасительную вакцину на тот случай, «если …», и т.п. SARS-CoV-2 стал объектом манипуляций обратной генетики еще до объявления пандемии COVID-19 [4]³. После объявления пандемии работы по получению синтетических вариантов SARS-CoV-2 приобрели взрывной характер [4–8]. В 2021 г. были созданы клеточные и векторные системы для получения вируса в количествах, выходящих за рамки нужд диагностических исследований [8]. Получение вариантов коронавирусов летучих мышей, способных вызывать инфекцию у других видов животных и в клетках человека [9], а также вариантов SARS-CoV-2, ранее не существовавших в природе [5–8], говорит о переходе генетических исследований коронавирусов на уровень синтетической биологии [10, 11]. В условиях затянувшейся пандемии COVID-19 и оставшимся неизвестным природным резервуаром SARS-CoV-2 такие исследования и их методология должны быть объектом пристального мониторинга, а его результаты – общедоступными.

Цель работы – показать, каким образом применение обратной генетики позволяет конструировать ранее не существовавшие коронавирусы, технологии и основные достижения в их создании.

Вся информация, использованная для подготовки данной статьи, находится в открытом доступе и может быть проверена по приведенным ссылкам на источники. Ее поиск проводился с помощью текстовой медицинской базы PubMed; поисковых возможностей Google Scholar, Научной электронной библиотеки eLIBRARY.RU и научных специализированных изданий.

Первые коронавирусные химеры

Одним из отличительных признаков вирусов семейства Coronaviridae является высокая специфичность к виду хозяина. Основной задачей исследований по получению коронавирусных химер в конце 1990-х гг. было выявление молекулярной основы взаимодействия коронавирусов с соответствующими им рецепторами клетки-хозяина. Ее решение облегчило бы понимание патогенеза коронавирусных инфекций, однако этому мешало незнание деталей процесса сборки вирионов. Возможность начать изучение роли отдельных белков в морфогенезе коронавируса предоставила новая технология – сборка коронавирусоподобных частиц (coronavirus-like particles, VLP) из коэкспрессируемых в культуре клеток белков M (белок мембранной матрицы), E (мембранный белок) и шипового гликопротеина (S-белок) без участия нуклеокапсида вируса (белок N). VLP высвобождались из клеток и образовывали гомогенную популяцию, морфологически неотличимую от нормальных вирионов [12].

Белки M и E могли самостоятельно образовывать VLP. Роль S-белка в сборке вириона и его почковании оставалась непонятной. Он сам транспортировался к плазматической мембране и удерживался в комплексе Гольджи за счет его ассоциации с белком М. S-мультимеры каким-то образом специфически вписывались в пустоты массивов мономеров M (или M и E), но они не вносили особого вклада в их общую стабильность VLP [13]. Стало очевидным, что S-белок, хотя и не требуется для сборки вируса, необходим ему для какой-то иной важной функции, например, для инфицирования клетки [14].

Что бы доказать роль S-белка в специфическом узнавании рецепторов на поверхности клеток-мишеней и таким образом показать его участие в инициировании инфекционного процесса, L. Kuo с соавт. [14]⁴ сконструировали мутант вируса гепатита мышей (mouse hepatitis virus, MHV), у которого эктодомен шипового гликопротеина (S) был заменен сильно дивергировавшим эктодоменом S-белка вируса инфекционного перитонита кошек (feline infectious peritonitis virus, FIPV). MHV и FIPV относятся к двум разным группам коронавирусов, и каждая из них высокоспецифична для соответствующего вида хозяина. S-белки MHV и FIPV имеют только 26% общей аминокислотной идентичности, их наибольшее расхождение происходит в аминоконцевой половине каждой молекулы. Они распознают разные рецепторы: MHV – членов семейства билиарных гликопротеинов мышей; FIPV – кошачью аминопептидазу N (fAPN).

Полученный жизнеспособный химерный вирус, обозначенный как fMHV, приобрел способность пересекать видовой барьер – т.е. инфицировать клетки кошек, и одновременно он потерял способность инфицировать клетки мыши в культуре ткани. Это реципрокное переключение видовой специфичности убедило исследователей в том, что диапазон клеток-хозяев коронавируса определяется, в первую очередь, на уровне взаимодействий между S-белком и рецептором вируса на клетке хозяина. S-белок коронавируса – основной и, возможно, единственный фактор его видовой специфичности. В то же время исследователи отдавали себе отчет в ограниченности использованного ими метода сайт-специфического мутагенеза для исследований экспрессии и функции генов из-за чрезвычайно большого размера генома коронавирусов – 28–32 т.п.н. [14].

Разработка обратной генетической системы конструирования коронавирусов

Получение полноразмерной кДНК⁵ гигантского (для вирусов!) генома, да еще в сочетании с участками нестабильности, способной в пермиссивных клеточных линиях сформировать полную инфекционную РНК вируса – для молекулярных биологов 1990-х гг. было сложной задачей. В начале нулевых годов ее решила группа Ральфа Барика, пойдя по пути деконструкции РНК-генома коронавируса на фрагменты кДНК, полученные с помощью ОТ-ПЦР⁶ или химическим синтезом. Затем эти фрагменты последовательно сшивали в соответствии с последовательностью РНК-цепи вируса, максимизируя стабильность генома. При необходимости вносили нуклеотидные замены в отдельные фрагменты. Полноразмерную кДНК вируса в условиях in vitro использовали качестве матрицы для транскрипции РНК с помощью РНК-полимеразы фага Т7. Полученная плюс-РНК генома коронавируса имитирует клеточную мРНК. Поэтому при введении в пермиссивную клетку она немедленно распознается ее машиной трансляции и запускает формирование собственных инфекционных вирусных частиц. То есть создатели такого способа синтеза вирусов пошли в «обратную сторону» – не от ДНК к РНК, как это обычно делается в клетке при синтезе белка, а наоборот, от РНК вируса к его кДНК, с нее «обратно» – к инфекционной РНК. Нуклеотидные замены и делеции, внесённые в кДНК-фрагменты перед их сшивкой в полноразмерную кДНК вируса, после транскрипции с нее РНК и образования вирусных частиц, если не знать об их искусственном происхождении, будут в эпидемических цепочках рассматриваться как мутации природного штамма вируса, например, Wuhan-Hu-1. В этом суть работы обратной генетической системы (англ. reverse genetic system, RGS) конструирования коронавирусов [15].

В настоящее время для получения синтетических коронавирусов используются две системы обратной генетики, предполагающие получение инфекционной плюсРНК в условиях in vitro [4–6, 16]; и две системы, позволяющие получение инфекционной плюсРНК вируса в условиях in vivo [7, 8].

Получение инфекционной плюсРНК коронавируса в условиях in vitro

Первопроходцами этой технологии стала группа Ральфа Баррика. Используя вирусы трансмиссивного гастроэнтерита (transmissible gastroenteritis virus, TGEV) и гепатита мышей (штамм MHV-A59), тогда наиболее изученных среди коронавирусов, они собрали полноразмерные кДНК обоих вирусов. На плазмидах были получены субклоны кДНК, охватывающие весь геном вируса. Затем субклоны кДНК «сшивали» вместе в условиях in vitro и получали интактную конструкцию кДНК, полностью соответствующую исходной плюс-цепи РНК коронавируса. Признаков сборки полноразмерной кДНК не оставалось. Транскрипты, полученные из полноразмерной кДНК коронавируса, с помощью электропорации вводили в пермиссивные клеточные линии (Vero E6), и в них начиналась сборка полноценных, обладающих инфекционностью, вирусных частиц [1, 2]⁷. Общая схема сборки клонов кДНК TGEV в полноразмерную кДНК инфекционного РНК-вируса показана на рисунке 1.

Полный геном SARS-CoV Urbani был собран этим же способом в виде шести смежных субклонов. Через уникальные сайты рестрикционной эндонуклеазы BglI их соединяли (лигировали) в полноразмерную кДНК вируса и в условиях in vitro использовали качестве матрицы для транскрипции РНК с помощью РНК-полимеразы фага Т7. Полученные РНК-транскрипты вводили в пермиссивные клетки с помощью электропорации, где по ним клеточная машина трансляции формировала инфекционные вирусные частицы [1].

Эта же технология, адаптированная Х. Xie с соавт. [5, 6]⁸ для получения синтетических производных SARS-CoV-2, представлена на рисунке 2. Она позволяет: 1) генерировать мутантные и репортерные SARS-CoV-2 и другие вирусы путем манипулирования плазмидой, содержащей фрагмент кДНК с необходимой мутацией (или мутациями), снижая риск нецелевых мутаций или делеций, непреднамеренно включенных в рекомбинантный вирус; 2) одновременно манипулировать множественными мутациями из разных фрагментов кДНК, так как для создания комбинаторных мутантных вирусов можно параллельно сконструировать более одной мутации из разных фрагментов кДНК. Такая гибкость важна при характеристике комбинаторного эффекта нескольких вирусных мутаций на иммунный ответ хозяина или течение болезни; 3) быстро вставлять в геном искусственного вируса мутации, обнаруженные у новых клинических изолятов или проводить замены участков генома исходного вируса на аналогичные родственных коронавирусов животных.

T.T.N. Thao с соавт. [4] предложили платформу для сборки крупных геномов коронавирусов, альтернативную платформе Ральфа Барика⁹. Их платформа использует для создания синтетических РНК-вирусов дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Обоснованием использования системы клонирования в дрожжах является способность дрожжей рекомбинировать перекрывающиеся фрагменты ДНК in vivo, что позволило разработать метод, названный клонированием с рекомбинацией, связанной с трансформацией (англ. transformation-associated recombination cloning, TAR). Субгеномные фрагменты вирусов были созданы T.T.N. Thao с соавт. [4] с использованием вирусных изолятов, клонированной вирусной ДНК, клинических образцов или синтетической ДНК, а затем эти фрагменты были повторно собраны в один геном в S. cerevisiae с использованием технологии TAR, позволяющей сохранить полученный рекомбинант качестве искусственной хромосомы в дрожжах¹⁰ [17]. Затем с помощью РНК-полимеразы Т7 получали инфекционную РНК репликационно способного вируса. Первоначально эта технология отрабатывалась на MHV A59 (рисунок 3).

Для оценки возможности применить платформу синтетической геномики к другим коронавирусам исследователи воссоздали MERS-CoV из восьми перекрывающихся фрагментов ДНК. В результате были получены рекомбинантные rMERS-CoV и rMERS-CoV-GFP. Этим экспериментом они показали, что платформа синтетической геномики подходит для модификации генома коронавируса. Синтетический rMERS-CoV-GFP уникален тем, что содержал вставку гена зеленого флюоресцирующего протеина (англ. green fluorescent protein, GFP), состоящего из 238 аминокислот (ММ 27 кД). Клоны синтетических вирусов пассировали на пермиссивных клетках 15–17 раз, последующее секвенирование показало, что полученные геномы стабильно сохранялись в процессе пассажей.

Далее T.T.N. Thao с соавт. [4] клонировали несколько других коронавирусов: HCoV-229E2, HCoV-HKU1 (GenBank: NC_006577), MERS-CoV-Riyadh-1734-2015 (GenBank: MN481979); и вирусов других семейств, таких как вирус ZIKA из семейства Flaviviridae (GenBank: KX377337) и респираторно-синцитиальный вирус человека из семейства Pneumoviridae (hRSV). Клонирование этих вирусных геномов с помощью технологии TAR во всех случаях было успешным, независимо от источника вируса, матрицы нуклеиновой кислоты или количества фрагментов ДНК. Клонирование hRSV-B осуществлено без какой-либо предварительной информации о геноме вируса, непосредственно из клинического образца (носоглоточный аспират) из четырех перекрывающихся фрагментов ДНК (GenBank: MT107528). В совокупности эти результаты демонстрируют, что платформа синтетической геномики TAR обеспечивает технический прогресс для быстрого создания молекулярных клонов различных РНК-вирусов с использованием вирусных изолятов, клонированной ДНК, синтетической ДНК или клинических образцов в качестве исходного материала.

Получение инфекционной плюсРНК непосредственно в пермиссивных клетках

Системы данного типа отличаются от описанных выше отсутствием этапа подверженной ошибкам транскрипции кДНК в условиях in vitro. Первая такая система обратной генетики была создана в 2020 г. Ye Ch. с соавт. [7]¹¹ на основе бактериальной искусственной хромосомы (BAC)¹². Она использована для генерации инфекционного рекомбинантного SARS-CoV-2 (rSARS-CoV-2), проявляющего в условиях in vivo свойства, аналогичные свойствам природного изолята вируса.

Исследователи химически синтезировали пять фрагментов генома штамма SARS-CoV-2, выделенного из мазка, взятого из ротоглотки пациента с симптомами респираторного заболевания в округе Снохомиш, штат Вашингтон (США). Они были собраны в плазмиде pBeloBAC¹³ с использованием стандартных подходов молекулярной биологии (рисунок 4).

Чтобы облегчить сборку вирусного генома, в него включили генетические метки, позволяющие отличить клон rSARS-CoV-2 от природного изолята – две молчащие мутации. Одна в гене S-белка (21895 нуклеотид), другая – в гене М-белка (26843 нуклеотид); удалив сайты рестрикции BstBI и MluI, соответственно (рисунок 4Б).

Для восстановления rSARS-CoV-2 клетки Vero E6 трансфицировали BAC SARS-CoV-2 и BAC (контроль), и в сравнении с контролем отслеживали наличие цитопатического эффекта в клетках, проявлявшегося через 72 ч после трансфекции. Продукция инфекционного вируса (пассаж 0) трансфицированными клетками составляла 3,4×10⁵ БОЕ/мл¹⁴ (рисунок 4Г). Восстановление rSARS-CoV-2 было подтверждено обнаружением вирусного антигена в клетках Vero E6, инфицированных супернатантами тканевых культур, собранных ранее из клеток Vero E6, трансфицированных SARS-CoV-2 BAC.

Несколькими месяцами позже аналогичная система разработана S. Rihn с соавт. [8]¹⁵. От описанной выше системы Ye Ch. с соавт. [7] она отличается тем, что для введения ДНК, кодирующей плюсРНК вируса в пермиссивные клетки используется не BAC, а плазмидный вектор. Прямую визуализацию и количественную оценку реплицирующегося вируса в клетках обеспечивали кассеты, содержащие маркеры. Исследователи назвали ее плазмидной системой обратной генетики (англ. reverse genetics, RG). Ими с использованием низкокопийной плазмиды pCC1-4K (не содержащей фактора F, отвечающего за конъюгацию плазмиды) на основе вируса Wuhan-Hu-1 создан инфекционный клон кДНК (icDNA) SARS-CoV-2.

Геном icDNA SARS-CoV-2 собран из 5 синтетических фрагментов ДНК, каждый из которых фланкирован уникальными сайтами рестрикции SanDI (1524), PacI (8586), MluI (13956), Bsu36I (18176) и BamHI (25313). Промотор цитомегаловируса человека (CMV) был вставлен в положение, соответствующее 5’-концу генома; двойной рибозим вируса гепатита дельта (HDV)¹⁶ и терминаторная последовательность вируса обезьяны 40 (SV40) были добавлены после поли-A-хвоста 3’-конца вирусного генома. Эти элементы обеспечивают эффективную транскрипцию и гомогенный процессинг 3’-конца во время спасения инфекционного вируса. Прямую визуализацию и количественную оценку реплицирующегося вируса в клетках обеспечивали кассеты, содержащие последовательности, кодирующие флуоресцентные (mCherry и ZsGreen) и биолюминесцентные (нанолюцифераза или NLuc) белковые маркеры¹⁷, вставленные в остов плазмиды. Чтобы избежать делеции вирусных последовательностей, маркеры клонировали внутри рамки считывания (in-frame) ближе к С-концу белка ORF7a с использованием линкера «пропуска рибосом» (2A) вируса ящура¹⁸. Так им удалось добиться высвобождения из белка ORF7a формирующегося репортерного белка (рисунок 5).

Разработанная S. Rihn с соавт. [8] плазмидная система обратной генетики позволяет получать репликационно-компетентный SARS-CoV-2 непосредственно из супернатантов клеточных культур. После трансфекции плазмиды в клетки BHK-21 их помещали в шестиячеечные плашки и после трехсуточного подращивания супернатант с вирусом переносили во флаконы T25, содержащие клетки Vero E6. Кроме того, эта конструкция SARS-CoV-2 легко поддается генетическим манипуляциям (для изучения вариантов вируса) и вставке репортеров, таких как флуоресцентные или биолюминесцентные белки, которые могут использоваться в различных исследованиях как в условиях in vitro, так и in vivo и обеспечивать прямое обнаружение и количественную оценку кинетики репликации вируса в клетке.

Изучение биологии химерных коронавирусов

Исследователям необходимо было понять масштабы изменения S-белка и в какую сторону их менять для расширения специфичности коронавируса в органах и тканях традиционного хозяина, и расширения диапазона его новых хозяев. Такие опыты велись с MHV. Диапазон хозяев и специфичность вируса пытались расширить путем его переключения с высокоспецифического рецептора (отдельные билиарные гликопротеины мышей) на неспецифический – гепаринсульфат (линейный полисахарид, обнаруженный во всех тканях животных). Что из этого получилось, из статьи неясно. Но времена изменились. Смертоносная эпидемия SARS сместила интересы исследователей с вариаций S-белка модельных MHV и FIPV к S-белку, обеспечивающему специфичность более опасных коронавирусов. Ключевой проблемой стал механизм, по которому они могут приобрести способность сменить «хозяина», т.е. передаваться от животного к человеку, и затем распространяться от человека к человеку [18]¹⁹.

K.E. Follis c соавт. [19] из University of Montana (Missoula, USA) обратили внимание на отсутствие у S-белка SARS-CoV сайта расщепления фурином и фуриноподобными клеточными протеазами, что приводило к его неполному расщеплению при взаимодействии с рецептором, а, следовательно, к неиспользованию всего патогенного потенциала вируса. Эта находка противоречила существовавшим тогда представлениям об особой роли протеолитического созревания в структуре и функции других гликопротеинов I класса, входящих в оболочки вирусов. Расщепление S-белка клеточными протеазами требуется для обеспечения потенциала слияния гликопротеинов оболочки ретровирусов, ортомиксовирусов, парамиксовирусов, филовирусов, аренавирусов и многих коронавирусов (MHV, коронавирусы птиц, CoV OC43), так как исходно они синтезируются как неактивные предшественники. Протеолитическое расщепление им необходимо для созревания и полной функциональной активности. После последующей активации созревшего гликопротеина оболочки класса I за счет связывания с рецептором и/или низкого эндосомального pH эти комплексы претерпевают глубокую структурную реорганизацию с образованием в конечном итоге высокостабильных структур – шпилек, способствующих эффективному слиянию вирусной и клеточной мембран [20].

С помощью алгоритма MAXHOM, использованного для выравнивание последовательностей предполагаемой области соединения S1–S2 S-гликопротеина коронавирусов, K.E. Follis с соавт. [19] обнаружили остатки фуринового сайта в гликопротеинах SARS-CoV, CoV 229E и NL63, исчезнувшего в результате спонтанных делеций. О некогда существовавшем сайте, чувствительном к протеазе, сигнализировал единственный аргинин (R) в положении 667 S-гликопротеина SARS-CoV. Введение синтетической последовательности распознавания фурина SLLR в R667, т.е. в предполагаемую область соединения S1–S2, сделало возможным эффективное расщепление S-гликопротеина с образованием дискретных субъединиц S1 и S2, и заметно увеличило способность комплекса шипов опосредовать слияние клеток, т.е. формировать синтиций.

Отсутствие фуринового сайта у SARS-CoV и без него приводящего к летальному исходу почти каждого десятого заболевшего атипичной пневмонией вызвало интерес у японских исследователей R. Watanabe с соавт. [21] из National Institute of Infectious Diseases (Tokyo, Japan). Они ввели фуринподобную последовательность расщепления в S-белок в аминокислотах с 798 по 801 и обнаружили, что S-белок теперь расщеплялся при экспрессии на клеточной поверхности и индуцировал слияние клеток без обработки трипсином. Кроме того, ими было обнаружено, что псевдотипированный вирус, несущий расщепленный S-белок, заражает клетки в присутствии лизосомотропного агента, а также ингибитора протеазы, оба из которых обычно блокируют проникновение SARS-CoV в клетку через эндосомы. Результаты R. Watanabe с соавт. [21] показали, что вставка фуринового сайта в S-белок SARS-CoV позволяет вирусу проникать в клетку непосредственно с ее поверхности.

Обнаружение SARS-подобных CoV (SL-CoV), идентичных по геномной организации с SARS-CoV, но отличающихся по связыванию с ACE2²⁰, поставило перед исследователями вопрос о том, насколько непреодолим для таких вирусов межвидовой барьер между людьми и летучими мышами. Иными словами, могут ли SARS-подобные CoV животных в результате случайной рекомбинации с геномами других коронавирусов приобрести способность вызывать инфекционный процесс у людей.

Первую попытку ответить на этот вопрос предприняла группа Ши Чжэнли. Для этого на основе вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) ими была сконструирована псевдовирусная система с клеточными линиями, экспрессирующими молекулы ACE2 человека, циветты или подковообразной летучей мыши. Псевдовирусы включали полноразмерный S-белок SL-CoV и SARS-CoV, и серию S-химер, включающих вставки различных последовательностей S-белка SARS-CoV в основную цепь S-белка SL-CoV. Они показали, что S-белок SL-CoV не может использовать ACE2 разных видов для входа в клетки. S-белок SARS-CoV также не может связывать молекулу ACE2 подковообразной летучей мыши Rhinolophus pearsonii. Однако, когда рецептор-связывающий домен (англ. receptor binding domain, RBD) S-белка SL-CoV заменяли на RBD S-белка из SARS-CoV, гибридный S-белок приобретал способность использовать человеческий ACE2 для входа в клетку (хотя и с разной эффективностью для разных конструкций), что означало структурное и функциональное сходство S-белков SL-CoV с S-белком SARS-CoV. Эти результаты предполагают, что хотя SL-CoV, обнаруженные у летучих мышей на момент проведения исследования, вряд ли заразят людей, еще предстоит выяснить, способны ли они использовать другие поверхностные молекулы определенных типов клеток человека. Также возможно, что эти вирусы могут стать инфекционными для человека, если они претерпевают вариацию N-концевой последовательности, например, путем рекомбинации с другими CoV, что, в свою очередь, может привести к продуктивному взаимодействию с ACE2 или другими поверхностными белками на клетках человека [3].

Группа Ральфа Баррика, в отличие от группы Ши Чжэнли, в исследованиях, посвященных взаимодействию «вирус-рецептор», не использовала псевдотипированные вирусы. Они считали эту систему безопасной, но слишком искусственной. Полученные на ее основе результаты трудно экстраполировать на реальный инфекционный процесс, так как она в принципе не может обеспечить правильную структурную экспрессию S-белка на вирионах. Поэтому, используя методы синтетической биологии и систему обратной генетики (рассмотрены выше на примере конструирования TGEV и MHV), они получили серию изогенных штаммов, соответствующих штаммам, обнаруженным у пальмовых циветт и енотовидных собак, а также изолятов SARS-CoV, охватывающих раннюю, среднюю и позднюю фазы эпидемии атипичной пневмонии. Синтезированные ими в условиях in vitro рекомбинантные вирусы эффективно реплицировались в культуре клеток и демонстрировали различную чувствительность к нейтрализации антителами. Человеческие, но не зоонозные варианты вирусов эффективно реплицировались в культурах эпителия дыхательных путей человека, подтверждая более ранние гипотезы о том, что зоонозные изоляты менее патогенны для человека, но могут развиваться в высокопатогенные штаммы. Все искусственные вирусы эффективно размножались в пермиссивных линиях клеток. Тяжелое поражение легких, проявляющееся диффузным альвеолярным повреждением, образованием гиалиновой мембраны, альвеолитом и смертью, было отмечено у 12-месячных мышей, зараженных интраназально штаммом пальмовой циветты HC/SZ/61/03 или вариантом SARS-CoV GZ02, выделенного во время ранней фазы эпидемии. Родственные линии штаммов SARS-CoV средней и поздней стадии эпидемии или енотовидных собак поражений легких не вызывали [22].

Этой же группой к 2008 г. был синтезирован SARS-подобный CoV, размером 29,7 т.п.н. (Bat-SCoV), вероятный, как они тогда считали, предшественник эпидемического SARS-CoV. К началу их исследования были идентифицированы четыре Bat-SCoV (HKU3–1, HKU3–2, HKU3–3 и RP3), но ни один из них не был выделен в культуре. Инфекционность этих вирусов была гипотетической, поскольку последовательности их геномной РНК получены путем ОТ-ПЦР секвенирования образцов генетического материала вирусов из фекалий или ректальных мазков летучих мышей. Для синтеза последовательности ранее не существовавшего вируса группой Ральфа Барика использовано консенсусное проектирование. Исследователи по четырем последовательностям Bat-SCoV, взятым из базы GenBank (номер доступа FJ211859), спроектировали консенсусную последовательность коронавируса и «разбили» ее на фрагменты кДНК с точками соединения, точно согласованными с существующей системой обратной генетики SARS-CoV. У вируса была произведена замена домена связывания рецептора Bat-SCoV Spike (RBD) на SARS-CoV RBD (Bat-SRBD). Были использованы определенные и функциональные 5’-UTR SARS-CoV и регуляторные последовательности транскрипции, поскольку 5’-UTR Bat-SCoV оказались неполными. Синтезированные фрагменты геномной кДНК вставили в плазмидные векторы и собрали в полноразмерную кДНК. Ее транскрибировали в условиях in vitro с получением РНК коронавируса, получившего обозначение Bat-SRBD. Он приобрел способность инфицировать культуру клеток и мышей [23].

Видимо пришло время для объединения усилий обеих групп. В их совместной работе, имеющей, по утверждению авторов, цель «предсказать и подготовиться к будущим вирусам», методом обратной генетики был создан ранее не существовавший вирус – SHC014-MA15, способный к репликации в дыхательных путях человека и животных [9]. Для этого в нуклеотидную последовательность субъединицы S1 циркулирующего среди летучих мышей коронавируса SHC014 – ближайшего «родственника» SARS-CoV, и не проявившего себя в качестве патогена для людей из-за различия по 14 аминокислотным остаткам в участке шипа, связывающегося с ACE2 человека, были внесены точечные изменения²¹. Исследователи заменили нуклеотидную последовательность гена, кодирующего субъединицу S1 у SHC014, на аналогичную от SARS-CoV. Остальные гены, т.е. те, которые определяют формирование транскрипционного комплекса вирусной репликации и сборку его частиц в клетке, изменениям не подвергались²². Новый химерный SARS-подобный коронавирус получил обозначение SHC014-MA15. Подобно SARS для инфицирования клеток легочного эпителия человека, циветты и летучей мыши, он может использовать ACE2 в качестве рецептора-мишени и его ортологи, и реплицироваться в них до высоких титров, сравнимых с таковыми у природного штамма SARS-CoV Urbani, оставаясь по остальным генам прежним SHC014. Эксперименты в условиях in vivo продемонстрировали репликацию химерного вируса в легких модельных мышей с выраженным патологическим процессом (рисунок 6)²³.

Но на общности способности субъединиц S1 узнавать ACE2-рецептор человека сходство обоих вирусов закончилось²⁴, проявился собственный патогенный потенциал вируса SHC014, о котором до этих экспериментов не подозревали, например, способность преодолевать искусственно созданный иммунитет. Исследователи попытались в условиях in vitro определить нейтрализующую эффективность в отношении SHC014-MA15 моноклональных антител (мАТ) широкого защитного спектра (109.8, SHC014-MA15, 230.15 и 227.14)²⁵, показавших хороший нейтрализующий эффект против SARS-CoV. Влияние этих антител на репликацию SHC014-MA15 оказалось незначительным, тогда как репликация SARS-CoV Urbani ими подавлялась при относительно низких концентрациях. Только использование высокой концентрации (10 мкг/мл) мАТ 109.8 позволило в условиях in vitro достичь 50 % нейтрализации SHC014-MA15 [9].

Чтобы оценить эффективность существующих вакцин в отношении HC014-MA15, исследователи вакцинировали мышей (Balb/cAnNHsD) кандидатной двойной инактивированной цельной SARS-CoV (DIV)-вакциной. Предыдущая работа показала, что вакцина DIV может защитить мышей от заражения гомологичным вирусом [25]. Однако вакцинация от SARS-CoV не только не защищала животных от заражения HC014-MA15, но и утяжеляла течение вызванного им инфекционного процесса. Сыворотка крови, полученная от мышей, вакцинированных DIV, не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 в условиях in vitro [9].

Попытка изготовить ослабленную живую вакцину на основе HC014-MA15 также оказалась неудачной. Ее использование давало незначительную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, что подтверждало наличие общих консервативных эпитопов, но возникли проблемы с безопасностью вакцинации. В тех дозах, которые обеспечивали некоторый защитный эффект от заражения SARS-CoV, вакцина сама вызывала патологический процесс у экспериментальных животных [9]. В целом эксперименты по получению из заражающего только летучих мышей коронавируса его генетически измененного варианта, представляющего опасность для людей, дали много эпидемиологии. Они позволили понять существующий в природе механизм межвидового «прыжка» коронавирусов от летучих мышей к людям. Пришлось избавиться и от иллюзии, что распространение в человеческих популяциях новых видов коронавирусов, образующихся в результате рекомбинаций, может быть сдержано вакцинами, созданными в отношении видов, уже циркулирующих в природе²⁶.

Поиски подходов к конструированию синтетических CoV и изучению их биологических свойств все чаще выводили исследователей на вирусные химеры, не контролируемые вакцинацией. С таким явлением столкнулись исследователи Icahn School of Medicine at Mount Sinai (New York, NY), создавшие на основе адаптированного к мышам SARS-CoV Urbani и S-белка вируса китайских подковоносов WIV1-CoV химерный вирус WIV1-MA15, у которого S-белок SARS-CoV был заменен на аналогичный из WIV1-CoV. Оказалось, что вакцинация двумя разными инактивированными вакцинами на основе SARS-CoV не смогла обеспечить защиту иммунизированных мышей от WIV1-MA15 [27].

Биологические свойства искусственных SARS-CoV-2

Для платформ обратной генетики коронавирусов получение SARS-CoV-2 – не более чем частный случай. Судя по заявлениям авторов опубликованных работ, обратные генетические системы, обеспечивающие быстрый синтез инфекционных штаммов SARS-CoV-2 дикого типа, его мутантных и репортерных штаммов, разрабатываются исключительно для изучения патогенеза вирусной инфекции, механизмов передачи, разработки методов терапии и создания вакцин [5, 6]. Используя такой клон можно оценить эффект генетических изменений вируса, удалив определенные последовательности из SARS-CoV-2 и изучив их влияние на репликацию вируса, процессинг S-белка, его иммуногенные и токсические свойства. Рекомбинантные SARS-CoV-2 (rSARS-CoV-2) обычно сравнивают с их природными изолятами по всей линейке маркеров, используемых для характеристики вируса. Клоны синтетических SARS-CoV-2 сохраняли стабильность на уровне исходных штаммов при 15–17-кратном пассировании в культурах тканей при сохранении геномов [4]. Чтобы дополнительно охарактеризовать генетическую идентичность rSARS-CoV-2 исходному штамму, используют секвенирование и рестрикционный анализ. Кинетика роста, пиковые титры, цитопатический эффект обычно аналогичны исходному штамму, выход вируса трансфицированными клетками мог составлять от 3,4×10⁵ БОЕ/мл [7] до 2,9×10⁶ БОЕ/мл вируса [5]. Восстановление rSARS-CoV-2 также подтверждалось обнаружением вирусного антигена в клетках Vero E6, инфицированных супернатантами тканевых культур, собранных ранее из клеток Vero E6, трансфицированных rSARS-CoV-2 [7].

Для сравнительных экспериментов по изучению свойств генетически измененных и природных вариантов rSARS-CoV-2 в условиях in vivo в настоящее время используют золотистых сирийских хомяков (Mesocricetus auratus) [28]. Ye Ch. с соавт. [7] для подтверждения того, что rSARS-CoV-2 проявляет ту же способность к репликации, вирулентность и патогенность, что и естественный изолят SARS-CoV-2, инфицировали обоими штаммами золотых сирийских хомяков интраназально в дозе 2×10⁴ БОЕ. На 2-е и 4-е сут после инфицирования они извлекли верхние и нижние дыхательные пути у инфицированных животных, а также у контрольной группы животных и оценили общие патологические изменения (легкие) и степень вирусной инфекции (верхние дыхательные пути и легкие) – рисунок 7.

Полученные Ye Ch. с соавт. [7] результаты экспериментов по интранозальному заражению хомяков показали невозможность различить по клинике и патоморфологии поражения, вызванные природными изолятами SARS-CoV-2 и его синтетическими копиями.

Создание отслеживаемых штаммов вируса SARS-CoV-2

Такие штаммы создаются путем включения в рамку вспомогательного белка ORF7a вируса генной кассеты с геном-маркером. Генная кассета обеспечивает гену маркера эффективную экспрессию при отсутствии вредного воздействия на реплицирующийся вирус. Наибольшим преимуществом у исследователей пользуются флуоресцентные и биолюминесцентные маркеры. Молекулярная масса используемых в настоящее время маркерных белков находится в пределах 26,7–19,0 кДа. Как правило, сконструированные методами обратной генетики отслеживаемые штаммы SARS-CoV-2 по своим культуральным свойствам не отличаются от природных изолятов [4–8, 29]. Используя нано-люциферазу в качестве маркера репликации вируса, A. Pickard с соавт. [29] идентифицировали 35 препаратов, подавляющих репликацию SARS-CoV-2 в клетках Vero и гепатоцитах человека (амодиахин, атоваквон, бедаквилин, эбастин, LY2835219, манидипин, панобиностат, витамин D3 и др.). Таким образом, данное направление конструирования синтетических SARS-CoV-2 перспективно для ускоренного отбора лекарственных средств, обладающих терапевтическим действием при COVID-19. Сам способ скрининга образцов с нужными свойствами по яркости свечения маркера легко автоматизировать.

Эксперименты с синтетическими коронавирусами сельскохозяйственных животных

В последние годы в конструирование коронавирусных химер стали вовлекаться коронавирусы сельскохозяйственных животных. Результаты отдельных экспериментов позволили не только показать возможность повышения вирулентности синтетических коронавирусов, но и обнаружить изменения в патогенезе вызванной ими болезни. Например, введением фуринового сайта в S-белок вируса бронхита кур (infectious bronchitis virus, IBV)²⁷, вызывающего у молодняка поражение органов дыхания, репродуктивных органов и нефрозонефритный синдром, была переключена его тропность с клеток дыхательных путей и мочеполовой системы на клетки ЦНС. Как это сделано, показано на рисунке 8.

Синтетический вирус rYN-S2/RRKR оказался более фатальным для куриных яиц с 10-суточным эмбрионом по сравнению с его родительским штаммом rYN. Инокуляция rYN-S2/RRKR приводила к гибели всех зародышевых яиц в течение 36 ч, тогда как для такого же результата штамму rYN требовалось более 96 ч. Кроме того, 50% инфекционная доза для эмбриона (англ. embryo infectious dose, EID50) rYN-S2/RRKR в яйцах была примерно в десять раз меньше, чем у rYN. При оценке патогенности rYN-S2/RRKR установлено, что летальные исходы при инокуляции rYN у цыплят достигали 10%, клиническая картина была типичной для бронхита кур; в то время как у цыплят в группе, инокулированной rYN-S2/RRKR, появились неврологические признаки, такие как тремор и паралич. Ранее о них никогда не сообщалось. Летальность зараженных цыплят составила 90%. У погибших после заражения rYN цыплят были обнаружены явные поражения дыхательной и мочевыводящей систем, включая слизь и точечное кровоизлияние в гортань, значительные отложения уратов в гортани, набухание мочеточника и почек. Цыплята, зараженные штаммом rYN-S2/RRKR, имели слизь и точечные кровоизлияния в гортани и не имели явных повреждений в почках. В образцах головного мозга в группах rYN и отрицательном контроле поражений мозга не обнаружено. В группе rYN-S2/RRKR наблюдались поражения ЦНС: значительная гиперплазия микроглии, образование микроглиальных узелков и периваскулярные воспалительные инфильтраты [32]²⁸.

Данный пример показывает последствия изменения всего двух аминокислот в сайте расщепления протеазой фурином. В результате произошло настолько значительное увеличение вирулентности IBV, изменение патогенеза и симптоматики бронхита кур, что эту болезнь можно было бы принять за ранее неизвестную, если не знать генетическую историю вызвавшего ее штамма вируса. Кроме бронхита кур большой ущерб животноводству приносят: коронавирус крупного рогатого скота (BCoV) – вызывает респираторную инфекцию и диарею у крупного рогатого скота; вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV) и вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) – вызывают диарею у свиней; вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита (PHEV) – вызывает у свиней рвоту и истощение.

Исчерпание возможностей экспериментов с S-белком коронавирусов

Рассматривая достигнутый уровень обратной генетики при конструировании коронавирусов, нельзя не заметить и то, что эксперименты с коронавирусными шипами к началу текущего десятилетия близки к пределу в своем развитии, они стали повторяться²⁹. И тому есть серьезные причины. У каждого типа вирусной архитектуры существуют свои структурные ограничения и предел вариации формы, размера или конфигурации вирусной частицы, которые могут быть реализованы с помощью определенного набора структурных белков и их модификаций. Когда этот допуск превышен, результат конструирования вирусной частицы становится неопределенным, процесс ее сборки начинает делать ошибки и тут уже вирусу не до «межвидового прыжка» при любых шипах. К тому же все «химеры» создавались по известному шаблону, т.е. по нуклеотидным последовательностям реально существующих вирусов и их отдельных генов, пусть даже принадлежащих разным видам. Их просто меняли местами и подгоняли аминокислотные последовательности шипа под более плотный контакт с рецептором клетки-мишени (замена неполярных аминокислот полярными), увеличивали процессивность шиповидного белка (т.е. добавляли сайт для расщепления фурином или другой протеазой)³⁰. В тоже время роль мутаций в неструктурных и вспомогательных белках в патогенезе и исходе COVID-19 изучена меньше, однако даже те ограниченные данные, что имеются, говорят за то, что она существенна (таблица 1).

Таблица 1 – Роль мутаций в неструктурных и вспомогательных белках SARS-CoV-2 в патогенезе и исходе COVID-19*

* По работе A. Nagy с соавт. [33].

Видимо следующим этапом обратной генетики при конструировании коронавирусов будет поднастройка неструктурных и вспомогательных белков, участвующих в проникновении вируса в эндосомы клетки, подавлении интерфероновой активности инфицированной клетки, усилении репликации вируса в конкретных клетках, проникновении в другие среды организма и др. В дальнейшем произойдет переход к полностью синтетическим коронавирусам, когда «шаблоны» и «консенсусное проектирование» для конструирования химер уже не потребуются, а вирус будет конструироваться компьютером с «нуля» под конкретные задачи, разумеется с целью получения новых вакцин и лекарственных препаратов.

Возможность создания вирусов с использованием подходов обратной генетики представляет собой мощный инструмент для ответа на важные вопросы биологии вирусных инфекций. Он позволяет понять механизмы вирусной инфекции, выявить вирусные факторы и факторы хозяина и взаимодействия, которые контролируют проникновение, репликацию, сборку и почкование вирусов в клетках. Кроме того, обратная генетика облегчает создание рекомбинантных вирусов, экспрессирующих репортерные гены, для их использования в клеточных скрининговых анализах или в моделях инфекции in vivo для быстрой и легкой идентификации профилактических и терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций, а также для создания аттенуированных форм вирусов для их использования в качестве аттенуированных вакцин.

Вклад автора/Autor Contribution
Идея и концепция статьи, поиск и анализ литературы, написание статьи, цифровая обработка изображений / Idea and concept of an article, search and analysis of literature, writing an article, digital image processing.

Информация о конфликте интересов
Автор заявляет, что исследование проводились при отсутствии любых коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сведения о рецензировании
Статья прошла открытое рецензирование двумя рецензентами, специалистами в данной области. Рецензии находятся в редакции журнала.

Список источников / References

1. Yount B., Curtis K., Baric R. Strategy for Systematic Assembly of Large RNA and DNA Genomes: Transmissible Gastroenteritis Virus Model // J. Virol. 2000. V. 74 (22). P. 10600–10611. https://doi.org/10.1128/JVI.74.22.10600-10611.2000

2. Yount B., Denison M. Weiss S., Baric R. Systematic Assembly of a Full-Length Infectious cDNA of Mouse Hepatitis Virus Strain A59 // J. Virol. 2002. V. 76(21). P. 11065–11078. https://doi.org/10.1128/JVI.76.21.11065-11078.2002

3. Ren W., Qu X., Li W., Shi Z. et al. Difference in Receptor Usage between Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Coronavirus and SARS-Like Coronavirus of Bat Origin // J. Virol. 2008. V. 82(4). P. 1899–1907. https://doi.org/10.1128/JVI.01085-07

4. Thao T.T.N., Labroussaa F., Thiel V. Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform // Nature. 2020. V. 582. P. 561–565. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2294-9

5. Xie X., Muruato A., Lokugamage K.G. et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2 // Cell Host Microbe. 2020 May 13. V. 27(5). P. 841–848.e3. https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.04.004

6. Xie X., Lokugamage K.G., Zhang X. et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system // Nat Protoc. 2021 Mar; V. 16(3). P. 1761–1784. doi: 10.1038/s41596-021-00491-8

7. Ye Ch., Chiem K., Park J-G et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a Single Bacterial Artificial Chromosome // mBio. 2020 Sep-Oct; 11(5): e02168-20. https://doi.org/10.1128/mBio.02168-20

8. Rihn S., Merits A., Bakshi S. et al. A plasmid DNA-launched SARS-CoV-2 reverse genetics system and coronavirus toolkit for COVID-19 research // PLoS Biol. 2021 Feb. V. 19(2). e3001091. doi: 10.1371/journal.pbio.3001091

9. Menachery V.D., Yount B.L., Debbink K., Baric R. et al. SARS-like cluster of circulating bat coronavirus pose threat for human emergence // Nat. Med. 2015. V. 21, № 12. P. 1508–1513. https://doi.org/10.1038/nm.3985/

10. Lakota Jan. Today`s Biothreats – Where the Past Predictions Meet the Future // Journal of NBC Protection Corps. 2020. V. 4. No 4. P. 421–440. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2020-4-4-421-430

11. Lakota Jan. Synthetic Biology – Friend or Foe? What Kind of Threats Should We Expect? // Journal of NBC Protection Corps. 2021. V. 5. № 2. P. 103–122. https://doi.org/10.35825/2587-5728-2021-5-2-103-122

12. Godeke G-J., de Haan C.A.M., Rossen J.W.A. et al. Assembly of spikes into coronavirus particles is mediated by the carboxy-terminal domain of the spike protein // J. Virol. 1999. V. 74. P. 1566–1571. https://doi.org/10.1128/jvi.74.3.1566-1571.2000

13. Opstelten D-J.E., Raamsman M.J.B, Wolfs K. et al. Envelope glycoprotein interactions in coronavirus assembly // J. Cell Biol. 1995. V. 131. P. 339–349. https://doi.org/10.1083/jcb.131.2.339

14. Kuo L., Godeke G-J., Raamsman M.J., Masters P., Rottier P.G.M. Retargeting of Coronavirus by Substitution of the Spike Glycoprotein Ectodomain: Crossing the Host Cell Species Barrier // J. Virol. 2000. V. 74(3). P. 1393–1406. https://doi.org/10.1128/jvi.74.3.1393-1406.2000

15. Perez D.R., Cockrell A.S., Beall A. et al. Efficient Reverse Genetic Systems for Rapid Genetic Manipulation of Emergent and Preemergent Infectious Coronaviruses // Reverse Genetics of RNA Viruses. 2017; 1602: 59–81. doi: 10.1007/978-1-4939-6964-7_5

16. Yount B., Curtis K.M., Fritz E.A. et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100(22). P. 12995–13000. https://doi.org/10.1073/pnas.1735582100

17. Kouprina N., Larionov V. Selective isolation of genomic loci from complex genomes by transformation-associated recombination cloning in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Nat Protoc. 2008. V. 3(3). P. 371-377. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.5

18. de Haan С., Li Z., Lintelo E. et al. Murine Coronavirus with an Extended Host Range Uses Heparan Sulfate as an Entry Receptor // J. of Virol. 2005. V. 79(22). P. 14451–14456. https://doi.org/10.1128/JVI.79.22.14451-14456.2005

19. Follis K.E., York J., Nunberg J.H. Furin cleavage of the SARS coronavirus spike glycoprotein enhances cell–cell fusion but does not affect virion entry // Virology. 2006. V. 350(2). P. 358–369. https://doi.org/10.1016/j.virol.2006.02.003

20. Eckert D.M., Kim P.S. Mechanisms of Viral Membrane Fusion and Its Inhibition // Annual Review of Biochemistry. 2001. V. 70. P. 777–810. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.70.1.777

21. Watanabe R., Matsuyama S., Shirato K. et al. Entry from the Cell Surface of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus with Cleaved S Protein as Revealed by Pseudotype Virus Bearing Cleaved S Protein // J. Virol. 2008. V. 82(23). P. 11985–11991. https://doi.org/10.1128/JVI.01412-08

22. Rockx B., Sheahan T., Donaldson E., Baric R. et al. Synthetic reconstruction of zoonotic and early human severe acute respiratory syndrome coronavirus isolates that produce fatal disease in aged mice // J. Virol. 2007. V. 81. P. 7410–7423. https://doi.org/10.1128/JVI.00505-07

23. Becker M.M., Graham R.L., Donaldson F., Baric R. et al. Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105(50). P. 19944–19949. https://doi.org/10.1073/pnas.0808116105

24. Sheahan T. Rockx B., Donaldson E. et al. Mechanisms of zoonotic severe acute respiratory syndrome coronavirus host range expansion in human airway epithelium // Journal of virology. 2008. V. 82. P. 2274–2285. https://doi.org/10.1128/JVI.02041-07

25. Bolles M., Deming D., Long K. et al. A double-inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine provides incomplete protection in mice and induces increased eosinophilic proinflammatory pulmonary response upon challenge // J. Virol. 2011. V. 85. P. 12201–12215. https://doi.org/10.1128/JVI.06048-11

26. Li F. Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins // Annu Rev Virol. 2016. V. 29; P. 237–261. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-110615-042301

27. Menachery V., Yount B., Sims A. et al. SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence // PNAS. 2016. V. 113 (11). P. 3048–3053. https://doi.org/10.1073/pnas.1517719113

28. Sia S.F., Yan L-M., Chin A.W.H. et al. Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters // Nature. 2020. V. 583. P. 834–838. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2342-5.

29. Pickard A., Calverley B., Chang J. et al. Discovery of re-purposed drugs that slow SARS-CoV-2 replication in human cells // PLoS Pathog. 2021 Sep 9; V. 17(9). e1009840. doi: 10.1371/journal.ppat.1009840

30. Medical aspects of chemical and biological warfare / Edit. F. R. Sidell, E. T. Tafuqi, D. R. Franz . Washington, 1997.

31. Jackson P.J., Ramsay A. J., Christensen C.D. et al. Expression of mouse interleukin-4 by a recombinant ectromelia virus suppresses cytolytic lymphocyte responses and overcomes genetic resistance to mousepox // J. Virol. 2001. V. 75, No 3. P. 1205–1210. https://doi.org/:10.1128/JVI.75.3.1205-1210.2001

32. Cheng J., Zhao Y., Xu G. et al. The S2 Subunit of QX-type Infectious Bronchitis Coronavirus Spike Protein Is an Essential Determinant of Neurotropism // Viruses. 2019. V. 11(10). 972. https://doi.org/10.3390/v11100972

33. Nagy A., Pongor S., Gyorffy B. Different mutations in SARS-CoV-2 associate with severe and mild outcome // Int. J. Antimicrob. Agents. 2021. V. 57. 106272. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.106272

34. Deigin Y., McCairn K., Sousa A. et al. Have artificial lighting and noise pollution caused zoonosis and the COVID-19 pandemic? A review // Environ. Chem. Lett. 2021. Jul 31: 1–10. doi: 10.1007/s10311-021-01291-y

35. Markson S. What really happened in Wuhan. Harper Collins Publishers Australia Pty Limited. ISBN 978 1 4607 6092 5. 2021.

• COVID-19