Особенности доклинических исследований на этапе разработки невирусных векторных конструкций, предназначенных для целей генной терапии

Автор:Михаил Васильевич Супотницкий, Е. В. Горбунова, Л. В. Корсун, Елена Владимировна Лебединская

Статья написана в соавторстве с Горбуновой Е.В., Корсун Л.В., Лебединской Е.В.

Резюме: Требования, предъявляемые при доклиническом исследовании лекарственных средств генной терапии, в настоящее время разработаны только для векторов на основе рекомбинантных вирусов. В работе рассмотрены особенности невирусных генотерапевтических векторных конструкций, которые необходимо принимать во внимание при доклинических исследованиях. Невирусная векторная конструкция состоит из трансгена (плазмидной ДНК с клонированным терапевтическим геном, управляемым через регионы транскрипции и инициации мРНК, регуляции терминации транскрипции и др.), включенного в специальный комплекс с другими высокомолекулярными соединениями, определяющими ее стабильность и способность к направленному введению генов в пораженные органы или клетки. К настоящему времени сложились три направления их конструирования: комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и катионными полимерами (полиплексы); комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и липидами (липоплексы); комплексы на основе наночастиц двуокиси кремния. Для обеспечения качества и безопасности таких препаратов, и проверки их подлинности, могут использоваться следующие показатели: химическая структура кополимеров, формирующих векторную конструкцию; ДНК-связывающая способность векторной конструкции; весовое соотношение ДНК/носитель; стабильность векторной конструкции; внутриклеточная миграция векторной конструкции; эффективность трансфекции векторной конструкции; гидродинамический диаметр; морфология; деградабельность полимеров, входящих в состав полиплексов; резистентность векторной конструкции к ДНКазе I, сыворотке крови и гепарину; дзета-потенциал, цитотоксичность векторной конструкции. Необходимо включение в Государственную фармакопею Российской Федерации соответствующих валидированных методов исследования и стандартных образцов.

Библиографическое описание: Супотницкий МВ, Горбунова ЕВ, Корсун ЛВ, Лебединская ЕВ. Особенности доклинических исследований на этапе разработки невирусных векторных конструкций, предназначенных для целей генной терапии. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения 2014; 3: 30–8.

Abstract: The requirements for preclinical studies of gene therapy medicines are currently developed only for vectors based on recombinant viruses. The present paper describes the characteristics of non-viral gene therapy vector constructs that need to be taken into account in preclinical studies. Non-viral vector construct consists of a transgene (plasmid DNA with a cloned therapeutic gene controlled by mRNA transcription initiation regions, regulation of transcription termination, etc.), included in a special complex with other macromolecular compounds, determining its stability and capacity for targeted gene introduction into the affected organs or cells. At the moment there are three construction directions: complexes formed by nucleic acids and cationic polymers (polyplexes); complexes formed by nucleic acids and lipids (lipoplexes); complexes based on silica nanoparticles. To ensure the quality and safety of these medicines at all stages of life cycle and confirm the identity the following parameters can be used: cytotoxicity of vector construction; chemical structure of copolymers forming the vector construct; DNA-binding ability of vector construct; DNA/carrier weight proportion; stability of the vector construction; intracellular migration of vector construction; transfection efficiency of vector construction; hydrodynamic diameter; morphology; degradation of polymers within polyplexes; resistance of vector construct to DNAase I, blood serum and heparin; zeta-potential. It is necessary to include the appropriate validated technologies in the State Pharmacopoeia of the Russian Federation.

Bibliographic description: Supotnitskiy МV, Gorbunova EV, Korsun LV, Lebedinskaya EV. Aspects of preclinical studies at the stage of developing non-viral vector constructions designed for gene therapy. Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products Bulletin 2014; 3: 30–8.

К генной терапии относят способы лечения наследственных болезней путем введения в ткани или клетки пациента генетической информации (генов, регуляторных элементов, малых интерферирующих РНК и др.) с целью замещения генных дефектов, либо выключения генов, экспрессия которых сопровождается патологическими эффектами. В конце 1990-х гг. способы генной терапии получили применение для лечения инфекционных болезней, что связано с изменением характера эпидемических процессов [1–3]. Накопленный к настоящему времени опыт внедрения в клиническую практику методов генной терапии показал, что проведение доклинических исследований, не учитывающее всех особенностей действия генотерапевтических препаратов, может привести к гибели пациентов при последующем изучении их безопасности и эффективности на этапе клинических исследований [4, 5]. Однако требования, предъявляемые к доклиническим исследованиям лекарственных средств генной терапии, в настоящее время разработаны только для той их части, которая использует в качестве векторов рекомбинантные вирусы [6, 7]. В монографиях Европейской фармакопеи и фармакопеи США невирусные векторы рассмотрены лишь как рекомбинантные плазмидные векторы, но не как комплексы плазмидной ДНК с другими высокомолекулярными соединениями, определяющими их стабильность и способность к направленному введению генов в пораженные органы или клетки[1]. Цель настоящей работы – рассмотреть особенности невирусных векторных конструкций, предназначенных для генной терапии соматических и инфекционных болезней человека, которые необходимо принимать во внимание при доклинических исследованиях еще на этапе их разработки.

Общие принципы создания невирусных векторных конструкций

Развитие данного направления конструирования векторов, предназначенных для генотерапии, связано с серьезными недостатками трансгенных конструкций на основе вирусных векторов, препятствующих их клиническому применению (антигенность, онкогенность и ограниченная емкость для включения трансгенов и др.) [8].

Разработчики невирусных векторных конструкций, прежде всего, учитывают то, что сахарофосфатный остов молекул плазмид располагается по их периферии полярными группами наружу, придавая им анионные свойства и гидрофильность. При физиологических значениях рН ДНК несет отрицательный заряд, отталкивающий ее от отрицательно заряженной наружной поверхности клеточной мембраны. В сыворотке крови плазмида, включающая трансген, быстро деградирует под воздействием нуклеаз. Кроме того, плазмиды не способны специфически узнавать клетки-мишени [/stat/stat89.htm#1]. Поэтому для специфической доставки генов в клетки необходимо включение плазмидной ДНК в специальные комплексы с другими высокомолекулярными соединениями, определяющими их стабильность и способность к направленному введению генов в пораженные органы или клетки.

К настоящему времени сложились три направления конструирования невирусных векторных конструкций:

  • комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и катионными полимерами (полиплексы, polyplexes);
  • комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и липидами (липоплексы, lipoplexes);
  • комплексы на основе наночастиц двуокиси кремния.

На рисунке 1 показаны общие механизмы формирования первых двух типов таких комплексов. Основные ограничения для доставки генов в геном человека с помощью невирусных векторных конструкций и способы их преодоления обобщены в таблице 1.

Рис. 1. Механизмы формирования невирусных векторных конструкций и их проникновения в клетку [10].

Рис. 1. Механизмы формирования невирусных векторных конструкций и их проникновения в клетку [10].

А. Формирование комплекса: имеющие отрицательный заряд нуклеиновые кислоты электростатически взаимодействуют с катионными липидами или поликатионами. В результате формируются положительно заряженные липоплексы или полиплексы.

Б. Положительно заряженные комплексы связываются со специфическими рецепторами (при наличии на их поверхности макромолекул, обладающих свойствами специфического лиганда) или непосредственно с поверхностью клетки. Комплексы проникают в клетку по механизму эндоцитоза. После высвобождения из эндосомы и разборки комплекса, нуклеиновая кислота проникает через поры в ядро клетки.

Таблица 1

Основные ограничения для доставки искусственными векторными системами генов в геном человека и способы их преодоления [9]

ОграничениеСпособ преодоления
Доставка генов к клетке и клеточный таргетинг
Деградация ДНК нуклеазами сыворотки кровиКонденсация ДНК или ее инкапсуляция катионными полимерами или липидами
Неспецифическое взаимодействие с компонентами кровиЭкранирование поверхности ДНК оболочкой из гидрофобных полимеров
Неспецифическое связывание тканями векторов, включающих трансгенВведение специфических лигандов в поверхность невирусной векторной конструкции, использование особенностей васкуляризации отдельных тканей (например, раковых опухолей)
Доставка генов внутрь клетки и их продолжительная экспрессия
Неэффективное поглощение ДНК клеткойВведение в поверхность невирусной векторной конструкции специфических лигандов, усиливающих рецептор-опосредованный эндоцитоз
Выход трансгена из эндосомыВключение мембрано-активных пептидов в оболочку невирусной векторной конструкции (например, аналогов меллитина). Формирование поликатионных «протоновых губок»
Транспорт трансгена из цитозоля в ядроПроникновение трансгена в клетку в составе наночастиц ускоряет их прохождение через цитозоль. Ядерная локализация сигнальных пептидов
Подавление экспрессии генаИспользование миникольцевой ДНК, лишенной бактериальных последовательностей
Утрата трансгенаМинихромосомы с эписомальными элементами для длительного поддержания трансгена в цитоплазме клетки. Экспрессионная кассета для трансгена, интегрирующаяся с хромосомой человека
Ответы со стороны организма человека и токсичность конструкции
Острая токсичностьЭкранирование поверхности для избежания агрегации в крови. Удаление контаминирующих поликатионов и бактериальных ЛПС
Цитотоксичность и длительное токсическое действиеИспользование в качестве носителей трансгенов биодеградируемых катионов
Клеточный иммунный ответВременная иммуносупрессия реципиента

В 1990-е гг. разработаны типовые структуры невирусных векторных конструкций, предназначенные для направленной доставки трансгенов в целевые клетки (печень, мозг и надпочечники, медуллярные двигательные нейроны, костные ткани, гладкая мускулатура кровеносных сосудов, опухоли эндотелия и др.). Одновременно оптимизирована структура трансгена. Для того чтобы ген мог автономно функционировать в данной ткани, в него включают специфичные для нее регионы транскрипции и инициации мРНК, регуляции терминации транскрипции.

Принципиально различаются и способы доставки плазмидной ДНК и невирусной векторной конструкции в пораженные ткани органа-мишени. Плазмидную ДНК вводят непосредственно в пораженную ткань путем электропорации, бомбардировки частицами, магнетофекции, струйного введения под давлением и др. (рис. 2).

Рис. 2. Прямое введение рекомбинантного плазмидного вектора в миокард [11].

Рис. 2. Прямое введение рекомбинантного плазмидного вектора в миокард [11].

А. Путем бомбардировки частицами (particle bombardment). Б. Путем струйного введения под давлением (jet injection).

Для доставки невирусных векторных конструкций используют непрямые способы: ингаляционный, энтеральный, внутривенный, ретроградный и др. Сама невирусная векторная конструкция создается таким образом, чтобы она была способна проходить через физиологические барьеры организма человека. На рисунках 3 и 4 показаны два разных подхода преодоления барьера между кровеносной системой и центральной нервной системой.

Рис. 3. Непрямое введение невирусной векторной конструкции в глубокие отделы мозга [12].

Рис. 3. Непрямое введение невирусной векторной конструкции в глубокие отделы мозга [12].

А. Векторная конструкция (размер ее частицы не превышает 30 нм), проникшая в дистальный участок нерва, подвергается активному ретроградному транспорту по двум механизмам: а) в составе эндосом; б) через прямое взаимодействие с моторными белками-динеинами, формирующими микротрубочки. Б. Искусственная векторная система, включающая денеин-связывающий пептид (DBP – dynein-binding peptide).

Рис. 4. Схема конструирования иммунолипосом, способных после внутривенного введения проникать в ядра нейронов ЦНС [13].

Рис. 4. Схема конструирования иммунолипосом, способных после внутривенного введения проникать в ядра нейронов ЦНС [13].

А. Суперскрученная плазмидная ДНК, включенная в иммунолипосому. Кодирующая трансген последовательность (codingsequence, cds) экспрессируется под контролем промотора (promoter, Pro) вируса SV40 и полиаденилирующей последовательности (polyadenylation sequence, pA). Приблизительно 1–2 % цепей PEG сшиты с мАТ, специфичными к таргетируемым рецепторам (R), запускающим транспорт иммунолипосомы через биологические барьеры в условиях in vivo. R1 — рецептор трансферрина, опосредующий трансцитоз через сосудистый эндотелий; R2 — рецептор инсулина, опосредующий эндоцитоз иммунолипосомы через мембраны клеток интракраниальной нейроэпителиальной опухоли (глиомы). Б. Трансмиссионная электронная микроскопия иммунолипосомы. Мышиные IgG, сшитые с концами цепей PEG2000 на поверхности иммунолипосомы и частицами золота диаметром 10 нм. Полоса соответствует 20 нм. В. Трехбарьерная модель генной терапии мозга (ГЭБ – гематоэнцефалический барьер; КМБ – клеточный мембранный барьер; БМЯ – барьер мембраны ядра; shРНК – малая интерферирующая РНК).

Полиплексы

Полимеры, используемые для конструирования полиплексов, делятся на две группы: деградируемые и недеградируемые. Из недеградируемых полимеров разработчики невирусных векторных конструкций наиболее часто используют полиэтиленимин (polyethylenimine; PEI) с молекулярной массой (ММ) 22 кДа. Он растворим в воде и состоит из множества этиленаминовых блоков (ethylenamine units), несущих положительный заряд. Использование PEI позволяет конструировать полиплексы с высокой плотностью положительного заряда на поверхности. Однако у деградируемых полимеров есть важное преимущество перед недеградируемыми – они менее токсичны. К ним относятся поли-L-лизин [poly(L-lysine), PLL] и его аналоги. Их деградируемость обусловлена включением в структуру полимера групп, чувствительных к гидролизу (сложные эфиры, ацетали или гидразоны), разрушающиеся внутри клетки под воздействием низких значений рН, ферментов и продуктов метаболизма [10, 13].

В конце 1990-х гг. разработаны технологии, позволяющие получить наноразмерные формы полиплексов (около 15 нм, т.е. размера глобулярных белков и рецепторов клеток) [14]. Нанополиплексы размером менее 25 нм эффективно трансфецируют неделящиеся клетки и доставляют гены в ядро клетки благодаря тому, что их размер меньше среднего диаметра пор мембраны ядра клетки. Нанополиплексы стабильны в солевых растворах. Конденсированный пептид, содержащий в своей структуре тридцатимерный полилизин с цистеином на N-конце, к которому «пришит» 10-кДа ПЭГ, при температуре 4°C стабилен в солевом растворе более трех лет; 9 месяцев он сохраняет свои основные свойства при комнатной температуре и один месяц – при температуре 37°C [15].

После взаимодействия полиплексов с поверхностью клетки их захватывают эндосомы. Но в отличие от вирусов, полиплексы обладают плохой способностью освобождаться из эндосом и в дальнейшем подвергаются деградации в лизосомальных компартментах (lysosomal compartments) клетки [16]. Поэтому в их состав вводят непротонированные амины (например, PEI). Они создают так называемый протон-поглощающий эффект (proton sponge effect), препятствующий закислению среды в эндосомах [17]. Протон-поглощающий эффект вызывает приток в эндосому ионов хлора и повышение осмотического давления внутри эндосомы. Эндосома разбухает, ее мембрана разрывается, векторная система проникает в цитоплазму клетки-мишени (рис. 5) [18].

Рис. 5. Протон-поглощающий эффект при высвобождении полиплекса из эндосомы [26].

Рис. 5. Протон-поглощающий эффект при высвобождении полиплекса из эндосомы [26].

Разрыв эндосомы происходит в результате притока ионов хлора и повышения внутреннего осмотического давления.

Производные PEI с ММ 25 кДа и более обладают выраженной токсичностью для клеток в условиях in vitro. В то же время полимеры с меньшей ММ формируют более эффективные и менее токсичные невирусные векторные конструкции. Высокомолекулярные PEI, производные от низкомолекулярных PEI, менее токсичны, и искусственные векторные системы на их основе обладают большей трансфецирующей активностью. Полиплексы, полученные путем комплексации ДНК с линейными PEI, формируют векторные системы, активные при внутривенном введении. Ветвящиеся производные PEI имеют большую токсичность и полиплексы на их основе обладают меньшей трансфецирующей активностью, чем на основе линейных полимеров. Но путем формирования поперечных сшивок между ветвящимися полимерами можно создать стабильные наночастицы, пригодные для ингаляционной доставки генов в организм человека. Для улучшения таргетирующей способности невирусных векторных конструкций PEI конъюгируют с инертными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) с ММ 5 кДa и декстраном, уменьшающих заряд на их поверхности и, соответственно, неспецифическое взаимодействие полиплекса с тканями организма человека при условии введения в их поверхность специфического лиганда [19].

Липоплексы

Липоплексы имеют общую структуру: положительно заряженная гидрофильная «голова» и отрицательно заряженный гидрофобный «хвост» соединяются через линкер. Наиболее часто в таких соединениях в качестве гидрофильной «головы» используются вторичные и четвертичные амины, или четвертичные аммониевые соли; реже – гуанидиновые, имидазольные, фосфорные, пиримидиновые и мышьяковистые группы. Положительно заряженная «голова» необходима для связывания с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот. Для уменьшения агрегации липосом исследователи избегают увеличения их концентрации в коллоидном растворе более 5 мг/мл (по содержанию ДНК) и добавления к ним хелатирующих агентов и солей. Такие растворы должны обладать нулевой ионной силой и содержать декстран [19].

Гидрофобные «хвосты» липоплексов обычно бывают двух типов по своим гидрофобным группам: алифатические цепи и холестериновые (холестерин и другие типы стероидных колец). Между гидрофильными и гидрофобными группами через эфирные, сложноэфирные, карбаматные и аминные группы формируются биодеградируемые связи. Распространенными в невирусных векторных конструкциях данного типа колипидами (colipids) являются холестерин и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE). Вклад этих липидов-помощников («helper» lipids) в катионопосредованный эндоцитоз зависит от структуры катионных липидов. Некоторые липиды в формировании структур, трансфецирующих клетки-мишени, зависимы от DOPE. В тоже время другие катионные липиды, имеющие двойные связи, способны самостоятельно формировать бислойные или мицелярные структуры, обладающие трансфекционной активностью.

Катионные липосомы, содержащие холестерин, разрабатывались для применения в условиях in vivo. Присутствие в мембране липосомы холестерина стабилизирует ее структуру и снижает деструктивную активность компонентов сыворотки крови. Высокой трансфецирующей способностью обладают липосомы с выраженной мембранной текучестью. Использование DOPE в качестве колипида увеличивает трансфецирующую способность липосом и облегчает освобождение липоплекса из эндосомы через дестабилизацию ее мембраны. Далее происходит декомплексация липосомы с высвобождением из нее ДНК трансгена. Вследствие избыточного поверхностного заряда, период полужизни катионных липосом при их циркуляции в крови непродолжителен [19].

Липоплексы имеют тенденцию к накоплению в кровеносных сосудах легочной ткани, преимущественно трансфецируя эндотелий и эпителиальные клетки дыхательных путей. Для увеличения длительности циркуляции липоплексов в крови человека и увеличения количества поражаемых клеток-мишеней, находящихся вне легочной ткани, разработчики липоплексов понижают их поверхностный заряд путем добавления гидрофильных и нейтрально заряженных полимеров, таких как ПЭГ. Введение в состав липосомы галактолипидов повышает их тропность к паренхиматозным тканям. Липосомы, содержащие DC-Chol (dimethylaminoethane-carbamoyl-cholesterol), обладают повышенной тропностью к клеткам гиппокампа головного мозга[2] [20]. Другой путь таргетирования липоплексов – введение в их состав специфических антител. Такие комплексы называются ПЭГилированными иммуносомами (PEGylated immunoliposomes, PILs). Они сохраняют коллоидную стабильность при внутривенном введении и эффективно доставляют гены в ЦНС [21, 22]. Липоплексы менее стабильны в растворах, чем полиплексы [23].

Наночастицы на основе двуокиси кремния

Развитие этого направления создания невирусных векторных конструкций прослеживается с 2005 г. [24]. Их основными преимуществами перед липо- и полиплексами их разработчики считают низкую токсичность, контролируемость размеров и простоту приготовления [25]. Они идеально подходят для ингаляционного введения генов.

Для получения векторов на основе двуокиси кремния Cheang Tuck-yun и соавторы [25] ковалентно сшили с поверхностью наночастицы двуокиси кремния силановое соединение аминопропилтриэтоксисилан (aminopropyltriethoxysilane, APTES)[3]. В результате на поверхности кремниевой частицы формировалась подложка, которая за счет аминокислотных концов молекулы APTES способна электростатически взаимодействовать с белками и двунитевой плазмидной ДНК. Благодаря высокой способности APTES растворяться в клеточных мембранах, такая наночастица легко проходит в цитоплазму клетки. Сорбирование на ее поверхности специфического лиганда нацеливает вектор на определенные клетки или ткани. Массовое соотношение двуокиси кремния и плазмидной ДНК в таких конструкциях 30:1. Их средний размер 174,5 нм (рис. 6).

Рис. 6. Невирусные векторные конструкции на основе частиц двуокиси кремния [25].

Рис. 6. Невирусные векторные конструкции на основе частиц двуокиси кремния [25]. Изображения получены с помощью сканирующего электронного микроскопа. Полоса соответствует 500 нм.

А. Увеличение в 150 000 раз. Б. Увеличение в 160 000 раз.

Критерии доклинической оценки невирусных векторных конструкций

При разработке критериев надо учитывать то обстоятельство, что до настоящего времени генотерапевтами не созданы невирусные векторные конструкции, пригодные для клинического применения во всех случаях (см. табл. 1). Основными недостатками таких векторов являются сложность создания высоких концентраций трансгена в клетках-мишенях и слабая изученность механизмов, обеспечивающих эффективный транспорт векторной конструкции в цитоплазме клетке и проникновения трансгена в ее ядро [26].

Анализ научной литературы показал разный «возраст» разработок, на основе которых создаются невирусные векторные конструкции, предназначенные для целей генной терапии [15, 19, 27, 28]. В практике экспертизы лекарственных средств это означает трудности в интерпретации приведенных заявителем результатов доклинических исследований генотерапевтических препаратов. Одни из таких препаратов будут получены на основе векторных конструкций, созданных по технологиям, хорошо известным в различных аспектах безопасного клинического применения, другие – по технологиям, еще не прошедшим апробации в других лабораториях, и по которым нет надежных критериев их доклинической оценки. Поэтому любой перечень физико-химических и биологических показателей, подлежащих изучению в доклинических исследованиях невирусной векторной конструкции и препарата на ее основе, должен корректироваться в зависимости от назначения, способа получения, способов введения в организм человека, имеющихся научных данных по его безопасности, безопасности компонентов и субстанций, включенных в препарат.

Особое внимание как разработчика, так и экспертов должны привлечь доказательства безопасности применения невирусных векторных конструкций, имеющих наноразмеры. Наночастицами низкомолекулярных веществ считаются объекты с размером до 10 нм, для высокомолекулярных – до 100 нм [29]. В научной литературе рассматривается вопрос о создании новой ветви токсикологии – нанотоксикологии, т.е. науки, изучающей потенциальную опасность наноструктур и наномеханизмов [15, 30, 31]. Причина этих опасений состоит в том, что наночастицы по размеру сходны с рецепторами клеток и молекулами, осуществляющими сигнальную функцию внутри клетки и могут вызвать биологические эффекты, не следующие логически из их химического состава и функции трансгена. Кроме того, размер наночастицы определяет много других биологических эффектов, например, биодоступность и продолжительность циркуляции препарата в кровеносном русле. Частицы размером менее 70 нм могут пенетрировать капилляры. Нанокомплексы размером в пределах 35–120 нм собираются в лимфатических узлах, где они могут вызвать воспалительный процесс. Частицы менее 40 нм способны проникать в ядро клетки и влиять на регуляцию генов [32, 33].

В настоящее время разработчики невирусных векторных конструкций характеризуют их свойства в основном по следующим критериям.

Химическая структура кополимеров – определяют с помощью ядерно-магниторезонансного способа (nuclear magnetic resonance, H-NMR) и инфракрасной Фурье-спектроскопии (Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR spectroscopy).

ДНК-связывающая способность векторной конструкции (DNA binding ability) – определяют электрофорезом в агарозном геле (0,8% агарозы в трис-ацетатном буфере с добавлением этидиумбромида). Количество оставшейся свободной ДНК в каждой фракции, сформировавшейся в агарозном геле, определяется количественно денситометрическим анализом.

Стабильность векторной конструкции – определяют таким же образом, как и его ДНК-связывающую способность, но в сравнении с образцами, инкубированными и неинкубированными (контроль) в эмбриональной бычьей сыворотке.

Внутриклеточная миграция векторной конструкции (trafficking) — прослеживается с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (confocal laser scanning microscopy, CLSM).

Эффективность трансфекции векторной конструкции. Так как в процессе переноса генов в клетку вирусы не участвуют, поэтому у разработчиков таких конструкций принято говорить не о трансдукции генов, а об их трансфекции. Эффективность трансфекции разработанной векторной конструкции определяют по интенсивности свечения клеток 293T, B16F10, HVSMC и HeLa, трансфецированных комплексом, включающим плазмиду с клонированным геном люциферазы (например, pGL-3 или pEGFP). Этот показатель используют для подбора оптимального для эффективной трансфекции соотношения компонентов векторной конструкции.

Весовое соотношение ДНК/носитель (ratio of DNA to carrier) –определяют электрофорезом в агарозном геле.

Гидродинамический диаметр (hydrodynamic diameter) векторной конструкции – определяют с помощью лазерной доплеровской анемометрии (laser Doppler anemometry) либо фотон-корелляционной спектроскопии (photon correlation spectroscopy).

Морфология векторной конструкции – характеризуется с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (transmission electron microscopy).

Деградабельность полимеров, входящих в состав полиплексов – оценивают по изменению их ММ после инкубирования в условиях, моделирующих условия их терапевтического применения.

Резистентность векторной конструкции к ДНКазе I, сыворотке крови и гепарину – оценивают путем инкубирования комплекса с этими компонентами в условиях, моделирующих условия их терапевтического применения. Затем выполняют электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле с этидиумбромидом, и денситометрическим анализом количественно определяют свободную ДНК в каждой фракции.

Дзета-потенциал (zeta potentials) векторной конструкции — электрический потенциал, который возникает при перемещении частиц между концентрированным слоем ионов на поверхности частиц и слоем ионов среды, окружающей частицы. Рассматривается как критерий устойчивости комплекса в коллоидной среде сыворотки крови. Определяют с помощью специальных анализаторов размера частиц и дзета-потенциала (например, серии Zetasizer Nano).

Цитотоксичность векторной конструкции – определяют с помощью МТТ-теста (MTT assay) на клетках 293T, мышиной меланомы B16F10 и HeLa. Тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде. Количество жизнеспособных клеток оценивают колориметрически по активности их митохондриальной редуктазы.

Подлинность трансгенной конструкции — определяют методом секвенирования нуклеотидных последовательностей.

При подаче в регулирующий орган документации для регистрации лекарственного средства соматической генной терапии, созданного на основе невирусной векторной конструкции, в досье доклинических исследований заявителем, в объеме, достаточном для подготовки экспертом регулирующего органа заключения о возможности его клинического исследования, также должны быть включены сведения по другим химическим, иммунохимическим и физико-химическим параметрам, используемым для доклинической оценки специфической активности, эффективности и безопасности лекарственного препарата [34–36].

Технологии, используемые для разработки и производства невирусных векторных конструкции и препаратов на их основе для генной терапии, непрерывно развиваются. Необходимо включение в Государственную фармакопею Российской Федерации валидированных способов, позволяющих обеспечить надлежащее качество и безопасность компонентов и субстанций, формирующих невирусные векторные конструкции, и препаратов для генотерапии на их основе. Кроме того, целесообразно включение в Государственную фармакопею стандартных образцов или стандартных материалов, что предоставит возможность разработчикам препаратов для генной терапии проводить сравнительный анализ в различных клинических исследованиях, производителям препаратов – проводить сравнительный анализ сырья, продуктов технологического процесса и примесей на различных стадиях производства.

Литература

  1. Миронов АН, Бунятян НД, Утешев ДБ, Радаев СМ, Коробов НВ, Яворский АН, Саканян ВА. Состояние и перспективы развития генотерапии в России. Вестник Росздравнадзора 2011; (4): 56–60.
  2. Богадельников НВ, Смирнов ГИ. Особенности течения инфекционных и эпидемических процессов в настоящее время. Актуальная инфектология 2013; (1): 68–72.
  3. Didigu С, Doms R. Gene therapy targeting HIV entry. Viruses 2014; 6: 1395–409.
  4. Noguchi P. Risks and benefits of gene therapy. N Engl J Med. 2003; 348(3): 193–4.
  5. Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivei NA, Bagg A, Gao GP, et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 2003; 80(1–2): 148–58.
  6. European Pharmacopoeia. 8th edition. 2011; P. 705–707.
  7. U.S. Pharmacopeia National Formulary. Currently Official USP 37–NF 32. 2014; P. 667–693.
  8. Oba M. Study on development of polymeric micellar gene carrier and evaluation of its functionality. Biol Pharm Bull. 2013; 36(7): 1045–51.
  9. Boeckle S, Wagner E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 2006; 8(4): 731–42.
  10. Halama A, Kulinski M, Librowski T, Lochynski S. Polymer-based non-viral gene delivery as a concept for the treatment of cancer. Pharm Rep. 2009; 61: 993–9.
  11. Katz MG, Fargnoli AS, Bridges SR. Myocardial gene transfer: routes and devices for regulation of transgene expression by modulation of cellular permeability. Human Gene Therapy 2013; 24: 375–92.
  12. Bergen JM, In-Kyu P, Horner PJ, Pun SH. Nonviral approaches for neuronal delivery of nucleic acids. Phar Res. 2008; 25(5): 983–98.
  13. Boado RJ, Pardridge WM. The Trojan horse liposome technology for nonviral gene transfer across the blood-brain barrier. J Drug Deliv. 2011; doi:10.1155/2011/296151.
  14. Thurmond K, Remsen EE, Kowalewski T, Wooley KL. Packaging of DNA by shell crosslinked nanoparticles. Nucleic. Acids. Res. 1999; 27(14): 2966–71.
  15. Davis PB, Cooper M. Vectors for airway gene delivery. AAPS J. 2007; 9(1): E11–E17.
  16. Suk JS, Suh J, Lai SK, Hanes J. Quantifying the intracellular transport of viral and nonviral gene vectors in primary neurons. Exp Biol Med. (Maywood). 2007; 232: 461–9.
  17. Akinc A, Thomas M, Klibanov AM, Langer R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. J Gene Med. 2005; 7: 657–63.
  18. Heath F, Haria P, Alexander C. Varying polimer architecture to deliver drugs. AAPS J. 2007; 9(2): E235–E240.
  19. Al-Dosari MS, Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations and recent progress. AAPS J. 2009; 11(4): 671–81.
  20. Harvie P, Wong FM, Bally MB. Use of poly(ethylene glycol)–lipid conjugates to regulate the surface attributes and transfection activity of lipid–DNA particles. J Pharm Sci. 2000; 89: 652–63.
  21. Pardridge WM. Drug and gene targeting to the brain with molecular Trojan horses. Nat Rev Drug Discov. 2002; 1: 131–9.
  22. Zhang J. Evolution by gene duplication: an update. Trends Ecol Evol. 2003; 18(6): 292–8.
  23. Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R,  Chan HW, Wenz M,  et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl Acad Sci USA. 1987; 84: 7413–7.
  24. Bharali DJ, Klejbor I, Stachowiak E, Dutta P, Roy I, Kaur N, et al. Organically modified silica nanoparticles: a nonviral vector for in vivo gene delivery and expression in the brain. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 11539–44.
  25. Cheang Tuck-yun, Tang Bing, Xu An-wu Chang, Hu ZJ, He WL, Xing ZH, et al. Promising plasmid DNA vector based on APTESmodified silica nanoparticles. Intern J Nanomed. 2012; 7: 1061–7.
  26. Nguyen J, Szoka FC. Nucleic acid delivery: the missing pieces of the puzzle? Acc Chem Res. 2012; 45(7): 1153–62.
  27. Haider HK, Elmadbouh I, Jean-Baptiste M, Ashraf M. Nonviral vector gene modification of stem cells for myocardial repair. Mol Med. 2008; 14(1–2): 79–86.
  28. Huang S-J, Wang T-P, Lue S-I, Wang L-F. Pentablock copolymers of pluronic F127 and modified poly(2-dimethyl amino)ethyl methacrylate for internalization mechanism and gene transfection studies. International Journal of Nanomedicine 2013; 8: 2011–27.
  29. Суздалев ИП. Физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов: М.: 2009.
  30. Goncalves DM, de Liz R, Girard D. Activation of neutrophils by nanoparticles. The Sci World J. 2011; 11: 1877–85.
  31. Бунятян НД, Утешев ДБ, Саядян ХС, Яворский АН. Современное состояние и перспективы развития нанотоксикологии. Фармация. 2008; (8): 3–5.
  32. Brown DM, Wilson MR, MacNee W, Stone V, Donaldson K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine poly-styrene particles: a role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicol Appl Pharmacol. 2001; 175: 191–9.
  33. Li N, Sioutas C, Cho A, Schmitz D, Misra C, Sempf J, et al. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage. Environ Health Perspect. 2003; 111: 455–60.
  34. Авдеева ЖИ, Медуницын НВ, Мовсесянц АА, Борисевич ИВ, Мосягин ВД, Алпатова НА с соавт. Основные требования к доклиническим исследованиям иммунобиологических лекарственных препаратов. В кн.: Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Иммунобиологические препараты. Часть вторая. М.: Гриф и К; 2012. С. 31–41.
  35. Авдеева ЖИ, Волкова РА, Алпатова НА, Борисевич ИВ, Медуницын НВ, Озерецковский НА, Эльберт ЕВ. Доклинические исследования препаратов, полученных с помощью методов генной инженерии. В кн.: Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Иммунобиологические препараты. Часть вторая. М.: Гриф и К; 2012. С. 241–57.
  36. Солдатов АА, Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Медуницын НВ, Борисевич ИВ. Общие принципы оценки качества и регистрации воспроизведенных биологических препаратов на основе белков, полученных с помощью генно-инженерных технологий, в соответствии с законодательством развитых стран. Биопрепараты 2012; (1): 8–16.

Библиографическое описание: Супотницкий МВ, Горбунова ЕВ, Корсун ЛВ, Лебединская ЕВ. Особенности доклинических исследований на этапе разработки невирусных векторных конструкций, предназначенных для целей генной терапии. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения 2014; 3: 30–8.

Bibliographic description: Supotnitskiy МV, Gorbunova EV, Korsun LV, Lebedinskaya EV. Aspects of preclinical studies at the stage of developing non-viral vector constructions designed for gene therapy. Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products Bulletin 2014; 3: 30–8.

[1] В настоящее время требования к производству и контролю качества лекарственных средств для генной терапии содержатся в Фармакопее США (монография <1047>) и Европейской фармакопее (монография <51400>).

[2] Гиппокамп — центральная часть лимбической системы – комплекса структур среднего, промежуточного и конечного мозга, участвующих в организации висцеральных, мотивационных и эмоциональных реакций организма.

[3] Силаны (кремневодороды, гидриды кремния) – соединения кремния с водородом общей формулы SinH2n+2. Аминопропилтриэтоксисилан используется в стекловолоконной и лакокрасочной промышленностях. Улучшает адгезию различных полимеров и покрытий (акрилаты, алкиды, полиэфиры, полиуретаны) к неорганическим субстратам (стекло, алюминий, сталь и др.). Повышает водостойкость и антикоррозионную устойчивость лакокрасочных материалов.